【目的】研制以杆状病毒表面展示系统为基础的猪瘟基因工程亚单位疫苗。【方法】利用杆状病毒表面展示(Baculovirus display)技术,构建展示猪瘟病毒(CSFV)囊膜蛋白的重组杆状病毒BacSC-E0E1E2,该重组杆状病毒带有His6标签,且胞质区域(CTD)和跨膜区域(TM)均来源于杆状病毒囊膜蛋白gp64的CTD和TM。对重组杆状病毒进行Western blot分析、激光共聚焦显微镜观察、免疫金电子显微镜检测、动物免疫试验、血清中和试验。【结果】Western blot分析结果表明,重组杆状病毒中表达了重组E0E1E2蛋白;激光共聚焦显微镜检测结果表明,重组杆状病毒感染昆虫细胞S...

通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增了猪瘟病毒(CSFV)的E0、E2和E012基因并进行了克隆与鉴定。构建了真核表达载体pcDNA-E0、pcDNA-E2和pcDNA-E012,通过与鼠白血病病毒(MuLV)假型病毒构建体系的两种质粒pHIT60和pHIT111瞬时共转染人胚肾细胞(293T),48h后收集假型病毒上清液,将假型病毒上清液超速离心后用抗CSFV的多抗进行Western-blot检测。结果证明E012蛋白能够在假型病毒颗粒表面表达,说明E012能够整合到此病毒粒子表面;用其感染多种宿主细胞,48h后检测发现在猪肾细胞(SK6,PK15)和猪睾丸细胞(ST)上,标记基因...

【目的】非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种严重危害猪养殖业的急性烈性传染病。【方法】为了制备特异性强、敏感性高的ASFV血清学诊断用抗原,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达了ASFV P30-54融合蛋白基因。将P30-54融合蛋白基因克隆入杆状病毒转座载体质粒pFastBac1中,构建重组质粒pFastBac-P30-54;将重组质粒转化DH10 Bac感受态细菌进行重组,经抗性与蓝白斑筛选得到杆状病毒重组质粒Bacmid-P30-54;将reBacmid-P30-54转染sf9细胞,获得重组杆状病毒reAcMNPV-P30-54。将获得的reAcMNPV-P30-54接种sf9细胞,待细胞出现CPE时收集细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)和SDS-PAGE进行分析重组蛋白的表达情况;通过Western blot检测重组蛋白的反应原性。【结果】在重组杆状病毒中成功表达P30-54蛋白,该重组蛋白可与ASFV多克隆抗体发生免疫学反应。【结论】证实该重组蛋白具有良好的反应原性。

【目的】原核表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)次要衣壳五邻体顶点蛋白(H240R),并研究其免疫原性。【方法】运用生物信息学软件初步预测分析H240R蛋白的理化性质、二级和三级结构。目的基因序列密码子优化后全基因合成,利用基因重组技术构建重组载体pET28a/H,通过原核系统表达目的蛋白,筛选最优的诱导温度和诱导时间。目的蛋白(包涵体)通过含2M尿素洗涤缓冲液洗涤和亲和层析进行纯化。利用梯度透析对纯化的目的蛋白进行复性,Western和Dot-ELISA鉴定复性的目的蛋白。复性蛋白和佐剂ISA201乳化后免疫小鼠,评价H240R蛋白免疫原性及其在小鼠体内诱导的抗体消长规律。【结果】生物信息学分析显示H240R蛋白分子量约为27 kDa,等电点为9.40,无跨膜结构域,抗原指数较高。成功构建大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/pET28a/H,在不同温度诱导条件下H240R蛋白均以包涵体形式表达。包涵体蛋白经过洗涤和亲和层析纯化后,纯度达85%以上。大约65%纯化蛋白可通过梯度透析进行复性。Western显示His抗体可以和融合蛋白结合显色,表明目的蛋白表达正确,Dot-ELISA显示阳性血清和复性的目的蛋白反应,表明复性的H240R蛋白具有正确的构象。复性蛋白免疫小鼠后,可刺激小鼠产生抗体,二免后10 d达到平台期,可以稳定持续30 d左右。【结论】ASFV衣壳五邻体顶点蛋白H240R在原核系统中以包涵体形式表达,纯化复性的目的蛋白具有良好的免疫原性,并且可以和阳性血清反应。这些可为进一步研究H240R蛋白的结构和功能,以及ASFV亚单位疫苗研制提供参考和思路。

为了鉴定CyHV-2的主要免疫原性蛋白，本研究用分离的CyHV-2-YC-1分离株感染异育银鲫尾鳍细胞系（GiCF），用蔗糖密度梯度超速离心法对细胞感染液中的CyHV-2进行纯化，纯化后的CyHV-2病毒免疫小鼠制备抗CyHV-2多克隆抗体。纯化的病毒颗粒经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色后，用抗CyHV-2多克隆抗体进行Western blotting分析和质谱鉴定。结果显示，透射电镜观察下发现50%～66%的蔗糖梯度多见完整囊膜包裹的CyHV-2病毒颗粒，也有少量囊膜破损的病毒颗粒。Western blotting结果显示，抗CyHV-2多克隆抗体与多种病毒蛋白具有特异性免疫反应，质谱鉴定显示，其中8种主要免疫原性蛋白分别是ORF92、ORF115、ORF25、ORF57、ORF66、ORF72、ORF131和ORF132。研究表明，通过蔗糖密度梯度超速离心法提纯CyHV-2病毒颗粒后，本研究制备的抗CyHV-2多克隆抗体能够特异性识别CyHV-2病毒的主要免疫原性蛋白。本研究将为CyHV-2免疫学检测方法的建立以及疫苗的研制提供更多的候选抗原。

为了研究坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)的免疫原性,利用大肠杆菌表达系统高效表达坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)并对其诱导小鼠免疫应答进行了研究。结果表明,E蛋白免疫BALB/c小鼠后,免疫组小鼠血清中抗体效价均可达1∶51 200以上;同时,E蛋白可显著诱导血清中细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ的表达,免疫组小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量均极显著高于对照组(P<0.01),IFN-γ含量则显著高于对照组(P<0.05);此外,与对照组相比,E蛋白还可极显著刺激小鼠脾脏淋巴细胞的增殖,上述结果表明,

为了获得具有标记的猪瘟病毒Erns蛋白,通过基因工程操作,使猪瘟病毒Erns基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合,用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中高效表达了ErnsGFP融合蛋白,经Western Blot和荧光显微镜观察证实,表达产物分子量正确,且发出易于检测的绿色荧光,具有标记的Erns蛋白的获得为进一步研究Erns蛋白结构和功能奠定了基础。

【目的】在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1-NTD蛋白,研究其免疫原性,为基于PEDV S蛋白的基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。【方法】PCR扩增PEDV S1-NTD基因,构建其重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD和重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD。将Ac-PEDV S1-NTD转染sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。将P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,Western blot鉴定重组蛋白的表达,空斑试验测定重组杆状病毒的滴度。在此基础上,分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,1和3的P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,并在感染后1,2,3,4和5 d收集细胞,通过Western blot和空斑试验分别检测目的蛋白的表达量和重组杆状病毒的增殖情况。将MOI为0.1的P3代重组杆状病毒皮下注射免疫BALB/c小鼠,每隔2周免疫1次,共免疫3次,以注射PBS、空载体Bacmid和PEDV商业疫苗为对照组,于首免后不同时间采集血液分离其血清,ELISA法检测血清中PEDV特异性抗体的水平;于首免后35 d剖取小鼠脾脏,分离其淋巴细胞;PEDV刺激后,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖情况。【结果】PCR扩增获得了约738 bp的PEDV S1-NTD基因;成功构建了重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD、重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD和重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。利用杆状病毒表达系统在sf9细胞内成功表达了重组PEDV S1-NTD蛋白,且杆状病毒以MOI为1感染sf 9细胞后在第3天蛋白表达量达到最高。在首免后35 d,重组杆状病毒免疫组小鼠血清效价达到最高值,为1∶5 000,与商业疫苗组效价一致;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD免疫组小鼠脾淋巴细胞对PEDV的刺激也发生了显著增殖(P0.05)。【结论】成功构建了重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD,在昆虫细胞中成功表达了PEDV S1-NTD蛋白,且具有较好的免疫原性。

将SARS冠状病毒(SARS-CoV)表面的主要结构蛋白刺突蛋白S144-643的基因片段(nt430-nt1929)克隆入表达质粒pET-28b中,并在大肠杆菌中表达。S144-643蛋白分子质量为55 ku左右,以包涵体形式存在于细菌中。ELISA及Western blot证明,S144-643可以与SARS康复病人的阳性血清发生特异性反应,免疫新西兰大白兔可以诱发产生较高水平的特异性抗体,因而证明原核表达的S144-643具有良好的免疫原性。

鲤春病毒血症病毒(SVCV)能够引起鲤科鱼类大量死亡,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的重要疫病,也是我国唯一被列为一类疫病的鱼类传染病。为建立SVCV的快速免疫学诊断方法,研究其主要结构蛋白间的免疫原性差异,实验首先采用原核表达系统克隆并诱导表达,纯化SVCV的核蛋白(N)、磷蛋白(P)和基质蛋白(M),并进一步免疫新西兰白兔制备抗血清,抗血清经Protein A柱进一步纯化获得3种蛋白的多克隆抗体。利用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫印迹实验(Western blot)对抗体效价和特异

选取鹅黄病毒囊膜蛋白(E蛋白)基因进行克隆、表达和纯化,以获得能应用于血清学诊断和可作为亚单位疫苗的重组蛋白。根据鹅黄病毒JS804株全基因序列设计了1对引物,采用RT-PCR方法扩增出了鹅黄病毒的E基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组表达质粒pET32a-E,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达。结果表明,鹅黄病毒E基因在大肠杆菌中获得高效表达,融合蛋白分子量约为70 kDa,主要以包涵体形式存在于菌体中。Western Blot和间接免疫荧光试验发现,重组E蛋白具有较好的反应原性和良好的免疫原性。鹅黄病毒E蛋白的原核表达为进一步研究该蛋白功能、建立血...

为研究重组猪肺表面活性蛋白A(RpSP-A)的抗病毒活性,采用Bac-to-Bac系统对RpSP-A蛋白进行表达。首先PCR扩增目的基因并将其克隆至pFastBac1转移载体获得pFast-SP-A,通过转化DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-SP-A,在sf9细胞上进行目的蛋白的表达,经镍柱纯化、脱盐柱处理后,采用蚀斑减少方法评价RpSP-A对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用。结果显示RpSP-A在sf9细胞中得到正确表达,并且能够降低PR

为研制检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的试剂盒,对IBRV gD蛋白主要功能域的表达及免疫原性进行研究。根据NCBI数据库录入的1型牛疱疹病毒(bovine herpesvirus type 1)gD蛋白序列(Gen Bank登录号为NC_001847)设计引物,用PCR扩增gD基因类免疫球蛋白结构域,构建原核表达载体pET32a–Δg D,转化大肠杆菌Rosseta(DE3)感受态细胞,并诱导重组蛋白表达。经SDS–PAGE分析,获得了相对分子质量约43 000的目的蛋白,该蛋白的相对分子质量与gD

以本实验室保存的REV毒株为模板,采用RT_PCR技术扩增了REV env部分基因,长为939 bp,并进行亚克隆到pMD18_T质粒载体上,连接、转化、鉴定后得到阳性重组质粒pET_env,将目的片段进行序列分析,结果表明,该REV的env基因与已发表的SNV株、中国HA9901株以及A株同源性均达94%以上,推导的氨基酸同源性为94%以上。将该基因片段与原核表达载体pET_32a重组,并将重组质粒转化至宿主菌BL21中,用IPTG诱导表达,对表达的蛋白用SDS_PAGE电泳,免疫印迹和薄层凝胶扫描分析,表达产物与理论推理一致;免疫印迹结果证明,表达的env蛋白可被REV阳性血清所识别。

为研制基于杆状病毒表达系统的大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,CGSIV)新型亚单位疫苗,将CGSIV主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因克隆至杆状病毒穿梭载体p Fast Bac1质粒中,构建了重组质粒p Fast Bac-MCP。转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经PCR筛选和测序获得了阳性重组杆粒r Bacmid-MCP,在昆虫细胞转染试剂介导下将该重组杆粒转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染