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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
白俊杰 叶星 李新辉 简清 罗建仁
用逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)方法 ,从猪脑垂体总RNA中扩增出编码猪生长激素 (GH)成熟肽基因序列 ,定向克隆至质粒pUC18。序列分析表明 ,克隆的猪GHcDNA长 5 73bp ,不含信号肽序列 ,并在该序列之前加入一起始密码子ATG。将猪GHcDNA定向克隆至原核表达载体pBV2 2 0 ,构建成重组猪GH基因表达载体pBVpGH7。SDS PAGE和薄层扫描分析表明 :经 42℃诱导 ,pBVpGH7在大肠杆菌中可表达一分子量约 2 2 0 0 0的特异蛋白 ,表达量约占细胞总蛋白的 2 0 .5 %。
[期刊] 水产学报
[作者]
张为民 张勇 李欣 张利红 田静
通过构建斜带石斑鱼垂体cDNA文库,克隆了其生长激素(GH)全长cDNA。斜带石斑鱼GH全长cDNA为955bp,编码的多肽为204aa。应用PCR方法把编码GH成熟肽的cDNA片段克隆到表达载体pET-15b,在大肠杆菌BL21(DE3)表达N端含6个组氨酸的融合多肽。SDS-PAGE结果表明,0.4mmol·L-1IPTG诱导表达的蛋白约为24kDa,主要为不溶性的包含体。细菌裂解液沉淀溶于6mol·L-1盐酸胍后,用Ni2+-NTA树脂进行亲和分离纯化,纯化产物在SDS-PAGE上表现为一条24kDa的蛋白带。在黑鲷GH放射免疫分析系统中,纯化产物能与黑鲷GH竞争结合GH抗体,表明大肠杆...
关键词：
斜带石斑鱼 生长激素 克隆 表达
[期刊] 水产学报
[作者]
陈松林 M.Schartl
应用RT—PCR技术从白鲢垂体mRNA中扩增出GH全长cDNA片段 ,长度 1.2kb。将 1.2kb白鲢GHcDNA克隆到载体质粒pBluescriptKSII +(pBSKSII +)中 ,构建了pBS -scGHcDNA克隆 ;通过含有NdeI酶切位点的特异引物扩增出不含信号肽序列的cDNA片段 ,将其重组到pRSET5b载体质粒中 ,构建了白鲢GHcDNA表达质粒pRSET -scGH。将此表达质粒转化BL2 1(DE3)大肠杆菌 ,经IPTG诱导后 ,在转化的大肠杆菌中检测到GH蛋白的存在。Western印迹表明该蛋白带与草鱼GH单克隆抗体具有强烈的免疫反应。
关键词：
鲢 生长激素cDNA 表达载体 大肠杆菌
[期刊] 中国水产科学
[作者]
白俊杰 马进 简清 李新辉 罗建仁 林文辉 张红军
采用聚合酶链反应 (PCR)技术对鲤和鲑生长激素cDNA的 5’端和 3’端进行定向改造。将改造后的5种基因分别克隆到大肠杆菌表达质粒 pBV2 2 0进行原核表达 ,以研究鱼生长激素基因在大肠杆菌中的表达水平。实验结果表明 :(1)核糖核蛋白体结合位点 (SD)与起始密码子AUG之间的距离对鱼生长激素的表达水平有影响 ;(2 )鲑生长激素基因的终止密码子UAG可能不会有效终止该基因在大肠杆菌中翻译的进行而造成部分通读 ,加入大肠杆菌强终止码UAA可避免通读和产生超长蛋白 ;(3)对鲤和鲑生长激素cDNA的 5’端和 3’端进行相同的修饰 ,但两者生长激素的表达量却有很大差异 ,说明基因的密码...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王慈 曹敏杰 郑晓江 詹春兰 刘光明 蔡秋凤
以鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肌肉cDNA为模板,利用小清蛋白特异性引物进行PCR扩增,克隆得到β小清蛋白两种不同亚型,即Ⅰ型、Ⅱ型编码区基因。将目的基因片段连接到pET28a(+)表达载体,并在大肠杆菌[E.coli BL21(DE3)]中诱导表达。结果表明,经诱导的小清蛋白重组质粒菌株有特异的蛋白表达。SDS-PAGE分析显示,目的蛋白的分子量约为13 kD,与预期大小一致。菌体超声破碎后发现2种亚型的小清蛋白均为可溶表达。利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,得到高纯度的重组小清蛋白PVⅠ和PVⅡ。经Western Blot鉴定,重组小清蛋白PVⅠ和P...
关键词：
鲢 小清蛋白 cDNA克隆 原核表达
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
闻雅男 王学英 夏润玺 王媛媛
为获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生物生物制剂,从自行筛选的黑曲霉中提取RNA,通过反转录合成模板cDNA,根据phyA成熟肽编码序列设计出一对引物,PCR扩增phyA,对扩增片段进行了克隆,通过限制性内切酶酶切分析、DNA测序证明phyA基因克隆成功。从pBS-T-phyA克隆中获取phyA编码序列,将其与pET28a+质粒连接,构建pET28a+-phyA重组质粒,并在大肠杆菌中获得高效表达。本研究成功克隆phyA,该基因全长1404bp,以ATG为起始密码子,TGA为终止密码子,编码467个氨基酸组成的多肽。SDS-PAGE电泳结果表明,phyA在大肠杆菌中成功表达,成熟植酸酶...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
熊帅 张军科 谌悦
【目的】从富士苹果幼果果实中克隆多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因,并进行原核表达,为进一步研究PGIP的生物学功能奠定基础。【方法】根据Genbank中已经发表的苹果PGIP基因序列设计引物,采用RT-PCR从苹果果实中扩增PGIP基因cDNA,回收目的基因片段并连接到pMD18-T载体,鉴定后进行测序。然后将PGIP全长cDNA和去信号肽的cDNA导入到pET-32a(+)表达载体中,分别获得融合表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X,将其分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用不同终浓度IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳。对pET-PGIP-X基因工...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张建成 杜俊杰 刘和 王鹏飞 薛晓芳 穆霄鹏 陈俊奇
【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis(Bge)Sok]八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,PSY)基因,并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA中间片段,再利用RACE技术获得该基因cDNA全长并分析其序列;然后利用PCR技术获得欧李PSY cDNA编码区全长,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-ChPSY,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA全长1 559 bp,...
关键词：
欧李 八氢番茄红素合成酶 克隆 功能表达
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李晶晶 赵德明 徐广贤 周向梅 尹晓敏
为观察重组MPB83蛋白的免疫活性,揭示该蛋白在牛结核病的诊断和防治中的作用,克隆了牛分枝杆菌MPB83基因,构建了克隆载体pGEM-MPB83和表达载体pET30a-MPB83,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。试验结果表明:牛分枝杆菌MPB83基因体外扩增产物与预期值相符,约600 bp;所构建表达质粒pET30a-MPB83经测序,结果与预期一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以包涵体的形式表达,其分子质量约为26 ku,蛋白表达量占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达95%以上;免疫印迹分析表明,...
[期刊] 草业科学
[作者]
马春娟 杨宇泽 邹爱爱 孙康永杰 万雪瑞 王川 魏亚琴
为提高纤维素的降解效率、构建高效表达的纤维素酶基因工程菌，本研究以牛瘤胃液微生物全基因组为模板，首先通过PCR扩增内切葡聚糖酶eg基因，然后与pET-28a连接获得表达载体pET-28a::eg并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21(DE3)中，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达EG蛋白，最后用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定重组内切酶的酶活力，分析其酶学性质。结果表明：成功构建表达载体pET-28a::eg，重组菌株E. coli BL21/pET-28a::eg在28℃用IPTG诱导14 h后纯化得到重组的EG蛋白，EG蛋白大小约为50 kDa，刚果红染色有明显水解圈。用DNS法测得EG的酶活为12.60 U·mL~(-1)，滤纸总酶活为3.53 U·mL~(-1)。重组酶在不同底物的反应中，羧甲基纤维素钠为底物的酶活力最高，脱脂棉最低。重组酶的最适温度为40℃，最适pH为7.0。在此条件下，Ca~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)、K~+、Mn~(2+)等离子均可对重组蛋白EG的酶活力具有促进作用，Zn~(2+)可促进但差异不显著，而Hg~(2+)、Cu~(2+)对EG的酶活力具有抑制作用。本研究构建的重组内切酶菌株可以高效水解纤维素，为内切酶的工业应用奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱春平 李燕 吴亚丽 常婧竹 刘琳 高文明 李新生
【目的】克隆和表达H3N2型猪流感病毒(SIV)A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的核蛋白(NP)基因,为制备NP抗体和SIV基因工程疫苗奠定基础。【方法】提取SIV A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的RNA,用RT-PCR扩增NP基因,将其定向克隆到pET-28a(+)原核表达载体,构建重组表达载体,并将其转化入大肠杆菌Rosetta中表达,用SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物,同时考察IPTG不同浓度(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mmol/L)和不同诱导时间(2,4,6,8h)对重组NP蛋白表达量的影响。【结果】克...
[期刊] 华北农学报
[作者]
黄冬艳 杨兵 齐欣 陈小玲 徐福洲
根据鸡贫血病毒Cux_1株基因组序列设计了一对引物,通过PCR扩增出VP1基因。将扩增出的片段克隆到pGM_T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux_1株的VP1基因序列一致。然后将克隆化VP1基因亚克隆到PET_32a(+)载体上并进行原核表达。SDS_PAGE和Western Blot分析表明,一个分子质量为70.4 kDa的重组蛋白获得了成功表达,并且鸡贫血病毒阳性血清能和重组蛋白发生反应。
关键词：
鸡贫血病毒 VP1基因 克隆 表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
古英洪 汤浩茹 张义正
【目的】克隆桃(Prunus persica)多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP)基因,并进行原核表达研究。【方法】根据李属植物pgip保守区域设计1对特异引物,以桃叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1kb的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达质粒,转化到Escherichia coli Rosetta-gami(DE3)pLysS中进行表达。【结果】测序结果显示,桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白cDNA编码区...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
罗维 余兴龙 白霞 李润成 侯强红 尹恒
根据Z26520中fedF序列设计1对引物,从发病仔猪的腹泻粪便分离获得的大肠杆菌中扩增得到fedF基因,经纯化、连接、转化,将其成功克隆到pMD18-T中,所克隆fedF基因序列与GenBank中收录的其他fedF基因序列的同源性达97.8%～99.2%.另设计1对引物,利用基因工程方法将所克隆的fedF的编码序列亚克隆到表达载体pBV220中,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得表达重组菌.测序结果表明,插入编码序列与预期序列一致.SDS-PAGE电泳及Western-blotting分析表明,重组菌在诱导后可以表达特异性的相对分子质量为30 100的FedF蛋白.
关键词：
大肠杆菌 fedF基因 克隆 表达
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
潘风光 宋德群 任洪林 艾永兴 柳增善
地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)是产生具有重要工业生产价值的耐高温α -淀粉酶(α -amylase)的优良菌株。在提取地衣芽孢杆菌基因组DNA基础上 ,通过PCR方法克隆了耐高温淀粉酶的全长基因1539bp ,与pUCm -T载体连接转化入克隆菌DH5α中 ,经过酶切鉴定筛选出阳性的克隆菌 ,再提取质粒与表达载体pET-28a( +)酶切后连接转化入宿主菌DE3中 ,其阳性重组子在37℃1.0mmol·L-1IPTG诱导下 ,α -淀粉酶的基因得到了较好的表达。表达产物经SDS -PAGE鉴定 ,确定表达蛋白的相对分子量为63000左右 ,与理论推导的分子量相一致。
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