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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
曹胜波 陈焕春 肖少波 何启盖 徐引弟 刘军发
根据国外已发表的猪环状病毒 2型 (PCV 2 )的全基因组序列 ,设计一对 2型特异性引物 ,对可疑病料进行PCR扩增。将扩增产物连接到pMD 18 T载体上并克隆到大肠杆菌DH5α中 ,经提取质粒进行PCR、酶切、测序鉴定 ,证明扩增出了PCV 2的目的片段。将测序结果与GenBank收录的PCV 2序列进行比较 ,发现同源性均在90 %以上。用该PCR方法在 43份可疑病料中检测到了 12份PCV 2阳性病料 ,表明该病在我国已有流行
关键词：
猪环状病毒2型 检测方法 聚合酶链反应
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
姜海军 陈琼 孔繁德 李国平 黄印尧 徐淑菲
参照GenBank收录的猪圆环病毒2型(PCV2)基因组全序列选择保守区域设计合成了引物及其探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqM an荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床采集的组织病料进行了检测,并与常规PCR检测方法作比较.结果显示,所建立的方法灵敏度可达3×101拷贝.μL-1,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)没有交叉反应,具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点,适合于PCV2的流行病学调查和临床诊断.
[期刊] 华北农学报
[作者]
李鹏 郭军庆 金前跃 李青梅 李清州 万博 王选年 王川庆 张改平
根据PCV2 ORF1设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠReal-time PCR检测方法。该方法灵敏度可达10~100拷贝/μL,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)以及猪细小病毒(PPV)没有交叉反应,利用该方法从50份临床病料中检测出43份阳性PCV2病毒,阳性检出率为94%。与常规PCR比较结果显示,该方法具有较高的灵敏度和特异性,能够快速检测和监控PCV2的感染流行。
[期刊] 华北农学报
[作者]
郭慧娟 李秀丽 张国伟 鄢明华 王利丽 张莉 孙英峰
通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了一种检测PCV2的SYBR Green荧光定量PCR方法。试验结果表明,该方法特异性强,与猪1型圆环病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等均无交叉反应。该方法最低可检测到10拷贝/μL的DNA,比PCR检测方法敏感性高1 000倍;其标准曲线线性范围是6.84×102~6.84×107拷贝,且具有良好的重复性。
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
于静 劳秀杰 陈彦永 何小江 代兵 赵阿勇 王晓杜 宋厚辉
猪圆环病毒２型（ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ２，ｐｃｖ２），是感染猪ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ的一种单链ｄｎａ病毒。建立一种快速、灵敏的检测方法，对于ｐｃｖ２感染猪的筛选和疾病预防非常重要。根据ｐｃｖ２ ｏｒｆ２基因保守区，设计了荧光定量聚合酶链式反应（ｐｃｒ）引物，利用ｓＹＢｒ Ｇｒｅｅｎ作为荧光染料建立了一种定量检测ｐｃｖ２的ｐｃｒ方法。结果表明：该方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的优点，每微升的最低检测限低至１０１拷贝ｄｎａ。利用该方法对３４份ｐｃｖ２阳性临床样本进行检测，检测符合率为１００％，明显高于普通ｐｃｒ方法的５０．０％。因此，本研究建立的ｐｃｖ２实时．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张帆帆 宋德平 周信荣 黄冬艳 李安琪 彭棋 陈燕君 吴琼 何后军 唐玉新
【目的】猪Ｄｅｌｔａ冠状病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，ＰＤｃｏｖ）是近年来新发现的可引起猪只，特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒，其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率，是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现ＰＤｃｏｖ ｒｔ－Ｐｃｒ检测方法，并调查当前江西腹泻猪群中ＰＤｃｏｖ的感染情况。【方法】通过对Ｇｅｎ Ｂａｎｋ数据库中ＰＤｃｏｖ全基因组序列的比对分析，找出保守序列，用Ｐｒｉｍｅｒ ３．０在线软件设计１对扩增ＰＤｃｏｖ核衣壳（ｎ）蛋白基因片段的特异性引物，基于该引物建立ＰＤｃｏｖ ｒｔ－Ｐｃｒ检测方法；用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品，挑选阳性扩增产物进行克．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
宏春慧 杨兵 覃湘婕 周宏专 徐福洲 苏霞 薛静 张晓东 王金洛
为鉴别猪博卡病毒１型、２型和３型３种基因型，根据猪博卡病毒基因序列分别设计３对针对保守区域的引物进行ＰＣＲ扩增，扩增目的片段大小分别为６４５ ｂＰ（ＰｂｏＶ１型）、３５２ ｂＰ（ＰｂｏＶ２型）和２５９ ｂＰ（ＰｂｏＶ３型）。通过引物浓度和退火温度等条件优化，首次建立了同时检测猪博卡病毒３种基因型的三重ＰＣＲ方法。所建立的三重ＰＣＲ方法扩增其他猪病病毒结果均为阴性，最低检测限为８×１０－７ｎｇ／μＬ。结果表明，该方法具有较好的特异性和敏感性。对临床样品进行三重ＰＣＲ和单项ＰＣＲ检测，对比结果显示符合率为１００％。该方法的建立为猪博卡病毒３种不同基因型的鉴别检测提供了有效手段。
关键词：
猪博卡病毒 基因型 三重PCR 检测
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
曹伟伟 郭抗抗 许信刚 宁蓬勃 刘伟 程敏 董玲娟 徐磊 高婉俊 任敏
【目的】建立一种能在临床上快速、准确检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中已公布的PCV-2陕西分离株的全基因序列,在PCV-2的ORF2核苷酸序列的保守区域,设计合成1条TaqMan探针和1对特异性引物;利用设计的引物扩增ORF2部分基因并鉴定后,回收PCR扩增产物,连接pMD19-T载体,转化DH5α大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定后提取质粒,作为荧光定量PCR的标准品;以标准品为模板建立检测PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价;用建立的荧光定量...
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
石林 吴瑗 巴少波 刘正奎 陈琳 王磊 邵春艳 孙静 周莹姗 王晓杜 宋厚辉
猪圆环病毒2型(PCV2)是一种引起仔猪Sus scrofa多系统衰竭综合征、免疫抑制、皮肤肾病综合征等疾病的病原体。根据GenBank中PCV2 ORF1基因序列设计合成特异性引物和探针,以PCV2基因组DNA为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段,并将目的片段克隆至pMD18-T载体,构建阳性标准品。以阳性标准品为模板,优化荧光定量PCR反应条件,建立标准曲线,进行灵敏性、重复性和特异性验证,并应用此方法对临床样品进行检测。结果表明:阳性质粒标准品构建成功,该检测方法的引物与探针的最佳浓度皆为0.2μmol·L~(-1),线性检测范围为2.1×10~(13)~2.1×10~6拷贝·L~(-1),最低检测限值为8.828×10~6拷贝·L~(-1),且与其他相关疾病无交叉反应;各批次检测变异系数低,检测方法稳定性好。本研究建立的敏感性高、特异性好的实时荧光定量PCR方法,为PCV2的快速检测提供了新工具。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
贾艳艳 李明凤 王东方 崔保安 陈红英 魏战勇 吕晓丽 郭显坡
【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪圆环病毒2型(PCV2)的SYBR-Green 1实时荧光定量PCR方法。【方法】根据已报道的PCV2ORF2基因组序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR扩增PCV2ORF2基因,将鉴定正确的ORF2基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR-Green 1荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】PCV2荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.9988,最低检测的拷贝数为1拷贝/25μL,特异性...
[期刊] 华北农学报
[作者]
路斌 王一成 吴润 袁秀芳 徐丽华 李军星 王朝文
通过对Genbank登录的CSFV、PRRSV和JEV的核苷酸序列进行比对分析,找出CSFV的E2基因,PRRSV的Nsp2基因和JEV的E基因为相对保守区域[1]。利用生物学软件在保守序列分别设计一对引物,通过对PCR反应条件的优化,确定了最佳引物浓度、最佳Mg2+浓度和最佳退火温度,建立了多重二温式PCR方法检测CSFV、PRRSV和JEV。其扩增的目的片断大小分别为CSFV(482 bp)、PRRSV(576 bp)和JEV(375 bp),将传统三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,从而大大节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对CSFV、PRRSV及JEV三种猪主要RNA病毒...
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵丽 崔保安 文英会 陈红英
根据Genbank上已发表的猪伪狂犬病毒(PRV)的gH基因和猪细小病毒(PPV)的VP2基因的保守序列,设计合成了2对特异引物,分别建立了PRV和PPV的单项PCR诊断方法,通过优化PCR条件最终成功地建立了PRV和PPV的复合PCR诊断方法。敏感性检测结果表明,对PRV的检测可以达到10-10.5/100μL TCID50、对PPV的检测可以达到10-9.5/100μL TCID50。对20头份病、死猪的血清、淋巴结、肺、肝等组织进行检测,结果5头份PRV阳性,3头份PPV阳性,其中3头份PRV和PPV同时为阳性,其余猪为阴性,健康猪对照样品全部阴性。结果表明,PRV和PPV复合PCR诊断...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
赵欣 贾鹏 刘莹 王津津 史秀杰 潘广 郑晓聪 于力 何俊强 刘荭 吴志新
本研究建立了定量检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,并与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法的灵敏性、重复性、特异性和临床样品检测做了比较分析。结果表明,与qPCR相比,ddPCR具有相同的特异性,其灵敏性比qPCR低20倍。在定量CyHV-2 DNA时,ddPCR(R2=0.994)和qPCR(R2=0.994)均表现出良好
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱小甫 张志 李晓成 陈德坤 吴旭锦
为了优化猪瘟病毒的RT-nested PCR检测方法,对福建省猪瘟流行情况进行了调查。根据GenBank上发表的猪瘟病毒Shimen株基因序列设计并合成了2对引物,优化了猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的RT-nested PCR检测方法,并对所优化的RT-nested PCR特异性进行了检验。结果表明,该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为1×10-7ng/mL,只有CSFV扩增出了272 bp的目的条带,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)阳...
[期刊] 水产学报
[作者]
周勇 曾令兵 张辉 范玉顶 徐进
针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1 446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒。经PCR鉴定与测序分析确认正确后,以10倍梯度稀释重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.999 1,斜率为-3.412;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×107copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出鲤疱疹...
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