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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孙岩 胡健 温俊歌 郜原 薄联锋 徐志坤 吴耀丽 张德礼
【目的】克隆猪淋巴结双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)基因,并在体外初步表达,为研究流感病毒感染时猪PKR与P58IPK在体内外的相互作用奠定基础。【方法】用Trizol法从猪淋巴结中提取总RNA,RT-PCR法扩增猪PKR基因的完整编码区,将该片段连接到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体pDsRed1-N1中,采用SDS-PAGE检测原核表达载体pGEX-PKR在大肠杆菌BL21中的表达情况,用脂质体转染法将真核表达载体pD-sRed1-PKR转入猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVECs),Western blot检测其在细胞中的表达。【结果】PCR扩增得到了1 754bp的DNA片段...
关键词：
猪PKR基因 克隆 原核表达 真核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王亭玮 刘转霞 陆佳 李沛轩 刘柯江 曾巍巍 索南吉 谢东旭 王雯慧
【目的】制备兔抗双峰驼Toll样受体5(TLR5)的多克隆抗体并鉴定其活性。【方法】选择双峰驼TLR5基因序列,经软件分析选择其编码区的膜外区1～499氨基酸位为主要抗原位,再选取对应的核苷酸序列进行基因合成,并与pET-28a(+)载体连接构建重组质粒pET28a-TLR5,对其进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。将pET28a-TLR5转染大肠杆菌原核表达系统,用IPTG进行诱导表达,对IPTG浓度(0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mol/L)和诱导时间(2,3,4,5,6,7,8,9 h)进行优化。将表达的蛋白经亲和层析法纯化后免疫新西兰白兔以制备多克隆抗体,采用ELISA法检测多抗效价,用Western blot检测和免疫组化验证评价多克隆抗体的特异性。【结果】成功构建了重组质粒pET28a-TLR5,经IPTG诱导后获得了重组蛋白(大小约为57 ku),且以包涵体的形式表达。IPTG最佳诱导表达条件为:IPTG浓度为1 mol/L,诱导时间为6 h。TLR5多抗血清效价为1∶128 000。Western blot鉴定表明,TLR5多抗血清能特异性识别目的蛋白;免疫组化结果表明,TLR5多抗能很好地识别成年双峰驼十二指肠肠系膜淋巴中的TLR5阳性细胞。【结论】成功制备出特异性良好的兔抗双峰驼TLR5多克隆抗体,能够用于TLR5的检测。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
郁晓梅 聂其灼
采用组织学和酶组织化学方法对16头猪的空肠淋巴结、腹股沟浅淋巴结和颈浅背侧淋巴结的组织结构进行了综合研究.结果表明,猪淋巴结组织结构并不完全属于皮质和髓质倒置,而是皮质可以位于外周,髓质可以位于中央,通常是皮质沿小梁分布.皮质由淋巴小结和弥散性淋巴组织构成;髓质无明显的髓索和髓窦,淋巴细胞数量少,T、B 淋巴细胞的分布类似于其他哺乳动物;树突状细胞、交错镶嵌型细胞、巨噬细胞和网状细胞的形态、分布以及组化反应也与其他哺乳动物相似.此外,在髓质中还发现一种特殊的网状细胞.
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张传茂 聂其灼
应用光镜和透射电镜技术对１７头猪的淋巴结髓质进行了研究．结果显示：猪淋巴结的化质主要由粗细两种网状纤维及常与其伴行的成纤维型风状细胞和特殊型网状细胞、淋巴细胞和浆细胞、巨噬细胞以及一种强嗜酸伊红性的颗粒细胞组成，但其中淋巴细胞和浆细胞的数量远少于其他哺乳动物淋巴结髓质．无明显的髓素，髓窦小且不明显．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
吕琼霞 张书霞 赵茹茜
为研究运输应激对猪肠系膜淋巴结中IL-2、IL-6、IL-10及其受体mRNA转录的影响,并探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)和核因子κB(NF-κB)对其转录的调控作用,用荧光定量RT-PCR方法对肠系膜淋巴结中3种细胞因子及其受体mRNA进行定量检测,用ELISA方法检测猪肠系膜淋巴结组织匀浆液中P38MAPK含量的动态变化,用激光扫描共聚焦显微镜观察运输前后NF-κB在肠系膜淋巴结细胞中的分布。结果显示:经1、2和4 h的运输应激,肠系膜淋巴结中3种细胞因子的转录均发生了显著变化,且均是4 h时达到最大值,并极显著高于对照组、1 h组和2 h组(P<0.01),而其相应受体的...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王贤丽 张玉喜 孟亮 陈松林
本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)从大菱鲆(Scophthalmus maximus)脾脏cDNA文库中克隆得到T淋巴细胞酪氨酸激酶(LCK)全长cDNA序列。该序列包含193bp的5′末端非编码区(5′UTR),1506bp的开放阅读框(ORF)和300bp3′UTR,整个开放阅读框编码502个氨基酸。系统发生分析表明,大菱鲆LCK基因与红鳍东方鲀(Fugu rubripes)和黑青斑河鲀(Tetraodon nigroviridis)的亲缘关系最近。在大菱鲆正常组织、胚胎细胞(TEC)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染的免疫器官组织中对LCK基因进行了RT-P...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
施旅娟 韩惠利 张书霞
【目的】了解PCV-2感染仔猪后,病毒在腹股沟淋巴结中的位置、凋亡细胞的类型及其两者之间的关系。【方法】选用9头32日龄PCV-2抗体阴性的普通断奶仔猪,随机分为3组,即对照组、PCV-2攻毒组(PCV-2组)、PCV-2攻毒后再用钥匙孔血蓝蛋白(KLH)刺激组(PCV-2+KLH组),每组3头。感染后32d采集腹股沟浅淋巴结制作石蜡切片。采用免疫组织化学方法对病毒进行定位,用末端标记法(TUNEL)进行细胞凋亡的定位测定,并用流式细胞法对细胞周期和细胞凋亡进行定量检测。【结果】PCV-2组和PCV-2+KLH组仔猪淋巴结的主要病变为皮质和副皮质区淋巴细胞严重缺失,上皮样巨噬细胞浸润,巨噬细胞...
[期刊] 水产学报
[作者]
臧坤 柳学周 徐永江 张凯 史宝 史学营 李存玉
利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得星突江鲽生长激素基因(GH)的cDNA序列全长为957 bp,其中开放阅读框(ORF)长615 bp,编码204个氨基酸,氨基酸序列与牙鲆同源性最高达到73.0%,系统进化显示,星突江鲽GH与其他鲽形目和鲈形目鱼类聚为一个分支。采用实时荧光定量PCR技术对GH基因的组织表达特性进行了分析,结果显示,GH基因mRNA主要在雌雄成鱼垂体中表达,同时在脑、性腺、肝脏、胃和肌肉中均检测到表达,雌鱼胃和肌肉中GH基因mRNA的表达量显著高于雄鱼(P<0.05),表明星突江鲽GH可能主要通过旁分泌和自分泌方式参与性别二态性生长调节。本实验成功构建了体外重组表达质...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张传茂 聂其灼
报道了猪淋巴结内一种特殊的嗜伊红性颗粒细胞（暂定名）的超微结构和几种酶的电镜细胞化学特征．该细胞主要分布于猪淋巴结的髓质和皮质一髓质交界区，呈圆形或椭圆形，核也呈圆形或椭圆形，细胞质中含有较多的特殊颗粒，其它类型的细胞器较少．特殊颗粒有单层膜包裹．内容物电子致密度高，Ｍｇ２＋－腺苷三磷酸酶（Ｍｇ２＋－ＡＴＰａｓｅ）、酸性磷酸酶（ＡＣＰａｓｅ）、非特异性脂酶（ＮＳＥ）、５＇－核苷酸酶（５＇－ＡＭＰａｓｅ）细胞化学反应均呈阳性．Ｍｇ２＋－ＡＴＰａｓｃ主要定位于细胞膜，ＡＣＰａｓｅ均匀分布于特殊颗粒内，ＮＳＥ分布在特殊颗粒膜和颗粒内，５＇－ＡＭＰａｓｅ主要定位于颗粒膜。
关键词：
猪 淋巴结 嗜伊红性颗粒细胞
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘伟 郭抗抗 林鸷 盛洁 赵娣 赵紫印 张彦明
【目的】克隆猪Jiv蛋白核心区的2 112bp的基因片段,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达和纯化,制备抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。【方法】利用RT-PCR方法,从猪脾脏组织RNA中扩增得到猪Jiv基因,将其克隆到pMD19-T载体并测序,以此为基础构建原核表达载体pET32a-Jiv,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导表达,获得大量包涵体形式的猪Jiv融合蛋白。通过镍离子螯合层析柱对表达的目的蛋白进行纯化,对纯化后的包涵体蛋白进行透析复性,以每只新西兰白兔400μg蛋白的初次免疫剂量和500μg蛋白的加强免疫剂量进行免疫,共免疫5次,采集血清,采用间接E...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张志远 张继希 徐红运 刘肖萍 卢晓艳 段二珍 夏平安 崔保安
应用RT-PCR技术从90日龄健康仔猪肺巨噬细胞中克隆出猪Fcγ亚单位的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-FcRγ,成功表达了分子量约为29 kDa的γ亚单位重组蛋白。将重组蛋白FcRγ-His免疫小鼠,制备获得鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体,将得到的重组蛋白多克隆抗体采用间接ELISA和Western-blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的效价为1∶8 000。Western-blotting结果表明,制备的鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体可以与重组γ亚单位蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
华利忠 张书霞 孙运 代蕾 陈耿 吕春子
为探讨猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)感染仔猪的淋巴结和脾脏淋巴细胞内钙信号变化在细胞凋亡中的作用,选取19头PCV2抗原和抗体均为阴性的5周龄健康断奶仔猪,随机分成对照组(4头)和试验组(15头),试验组仔猪通过滴鼻接种PCV2,并于接种后14、21和35 d分别扑杀5头,对照组仔猪滴鼻同量PBS后当天扑杀。所有仔猪扑杀时均取腹股沟淋巴结及脾脏,流式细胞术检测细胞凋亡率,荧光分光光度法检测细胞内Ca2+浓度,孔雀绿比色测定法检测Ca2+-ATP酶的活性,荧光定量RT-PCR检测钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)mRNA转录水平。结果表明:所有接种病毒仔猪腹股沟淋巴结及脾脏细胞凋亡率均极显著高...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李晓琳 郭华 刘子臣 段滇宁 张亚群 韩俊源 张书霞
选取6头猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原及抗体均为阴性的普通断奶仔猪,无菌取脾脏,制成单个细胞悬液进行体外培养,并分为PCV2组和对照组,PCV2组用PCV2与脾细胞共同培养,对照组加等量RPMI-1640培养液。分别于培养0、6、12、24和48 h后收取悬浮的淋巴细胞,用间接免疫荧光法检测PCV2感染淋巴细胞的情况,相对定量RT-PCR法检测淋巴细胞中TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9 mRNA的表达量,Western blot检测TLR3和TLR4的蛋白表达情况。结果显示:PCV2感染后,TLR2和TLR9 mRNA的表达量在1...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
杨琪 何诚 雷鸣 杨利 朱虹 端青
为观察重组MOMP蛋白的免疫活性,揭示omp1基因(编码MOMP蛋白)在猪流产衣原体诊断和防治中的作用,用PCR法扩增猪流产衣原体omp1基因,将特异性扩增片段克隆入pMD18T载体,测序比较分析序列后确认为目的基因,与GenBank中4株流产衣原体omp1基因和氨基酸序列的相似性均达99%,与其他各型衣原体代表株的相似性为71%～88%,氨基酸序列也有较大差异。将omp1基因亚克隆到pET32a表达载体上,再对重组表达载体转化BL21(DE3)表达宿主菌,以IPTG诱导该重组菌,结果显示该重组菌表达了融合蛋白;用猪流产衣原体多克隆抗体对表达的重组MOMP蛋白进行Westernblot试验,结...
关键词：
猪流产衣原体 主要外膜蛋白 克隆 表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
方剑玉 朱文豪 李海利 郭小参 白献晓 王克领
为研究猪Viperin蛋白在猪体内的抗病毒活性,用IFN-α刺激PK-15细胞24 h,收集细胞提取RNA后,采用RT-PCR方法扩增猪Viperin基因,并连接至p EASY-blunt simple平末端连接测序载体,PCR鉴定后送公司测序正确。采用DNAStar分析猪Viperin蛋白的免疫原性和疏水性,选取抗原性较好的一段基因,采用PCR扩增后,插入pET-28a+大肠杆菌表达载体,在37℃条件下用IPTG诱导含有重组质粒的大肠杆菌BL21,SDS-PAGE分析证明,Viperin重组蛋白以包涵体的形式表达,包涵体蛋白经过纯化后得到目的蛋白,将纯化蛋白与弗式佐剂进行乳化后颈背部皮下注射9日龄的BALB/c小鼠,14 d后加强免疫一次,收集小鼠血清。采用Western Blot、IFA鉴定制备多克隆抗体的特异性,该多克隆抗体可以和阳性sViperin真核表达载体pCI-sVIP等表达的猪源Viperin蛋白进行特异性反应。试验成功克隆了猪Viperin基因,并制备了良好Viperin蛋白的多克隆抗体。
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