为了检测猪血清中猪流行性腹泻病毒抗体水平,用纯化的猪流行性腹泻病毒N基因重组表达蛋白作为包被抗原,建立了检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA方法。ELISA的最佳工作条件是:抗原包被浓度为0.5μg/m L,包被时间4℃过夜,5%脱脂乳的PBS封闭37℃2 h及4℃过夜。血清稀释度为1∶100;37℃作用45 min,辣根过氧化物酶标记兔抗猪Ig G稀释度为1∶10 000,37℃温育60 min,底物显色37℃15 min。抗体临界值为OD450nm≥0.30判为阳性,OD450nm≤0.27判为阴性,介于二者之间判为可疑。经重复性试验和交叉试验,结果表明,该方法特异性强、灵敏度高、重复...

本试验设计了M基因的特异性引物,扩增了M基因,成功构建了重组质粒,并转化至Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中,优化了异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达条件.结果表明,重组表达的融合蛋白Pet-32a-M大小约为43 ku,与预期大小相符.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表明,M蛋白为包涵体蛋白,且在IPTG浓度为0.8 mmol·L-1,温度为37℃,诱导时间为8 h的条件下,蛋白表达效果最佳.蛋白免疫印迹检测结果进一步显示,重组蛋白Pe

猪流行性腹泻病毒(porcine epizootic diarrhea virus,PEDV)的M和S蛋白与中和抗体的形成有关,同时获得这两种蛋白质对预防和控制PED有重要的意义.本研究在实验室保存的M蛋白重组质粒的基础上构建了Pet-32a-M-S串联重组质粒.通过PCR鉴定、酶切鉴定和测序证实串联重组质粒构建成功.将Pet-32a-M-S质粒转染到BL21感受态细胞中,筛选诱导的最佳条件,最后进行Western blot鉴定.结果表明,串联重组蛋白最佳诱导条件为25℃、8 h、0.6 mmol·L-~(1)IPTG; Western blot鉴定结果表明,重组质粒能够同时诱导PEDV的S和M蛋白.因此,本试验成功获得PEDV S和M蛋白在体外的串联诱导表达,为PEDV亚单位疫苗的研究提供了基础.

【目的】制备猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白及其多克隆抗体,建立检测PDCoV N蛋白抗体的间接ELISA方法。【方法】从PDCoV CH-01毒株中扩增N全基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,转入BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组N蛋白,并对该蛋白的反应原性进行鉴定。诱导表达的N蛋白经镍柱纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。同时用镍柱纯化后的N蛋白作为包被抗原,建立PDCoV的间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、重复性和稳定性进行检测,并利用该方法对河南部分地区猪场送检的165份临床猪血清样本进行PDCoV抗体检测。【结果】成功克隆了1 026 bp的N基因,构建了重组表达载体pET-28a-PDCoV-N,经诱导表达后获得了重组N蛋白,其相对分子质量约42.9 ku,Western blot分析表明所表达的蛋白可与抗PDCoV全病毒猪阳性血清发生反应。制备的PDCoV N蛋白多克隆抗体经Western blot检测表明,该抗体具有特异性;间接免疫荧光试验测定该多克隆抗体在ST细胞上的最佳使用稀释度为1∶200。以N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,确定最佳的反应条件如下:抗原2μg/mL在4℃过夜包被,10 g/L BSA在37℃下封闭2 h,血清(1∶80稀释)37℃孵育1 h,酶标二抗(1∶6 000稀释)37℃孵育1 h,TMB在37℃下显色15 min;待检血清OD_(450)值≥0.272判定为阳性。特异性试验结果显示,该包被抗原与其他猪常见病毒的阳性血清均无交叉反应,批内和批间重复试验变异系数均小于5%。用间接ELISA法对来自河南不同地区的165份血清样本进行检测,结果表明各地样本PDCoV抗体阳性率平均为53.94%。【结论】成功表达了PDCoV N蛋白,制备了其多克隆抗体,建立了PDCoV间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,可用于临床猪血清中PDCoV抗体的检测。

【目的】在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1-NTD蛋白,研究其免疫原性,为基于PEDV S蛋白的基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。【方法】PCR扩增PEDV S1-NTD基因,构建其重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD和重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD。将Ac-PEDV S1-NTD转染sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。将P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,Western blot鉴定重组蛋白的表达,空斑试验测定重组杆状病毒的滴度。在此基础上,分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,1和3的P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,并在感染后1,2,3,4和5 d收集细胞,通过Western blot和空斑试验分别检测目的蛋白的表达量和重组杆状病毒的增殖情况。将MOI为0.1的P3代重组杆状病毒皮下注射免疫BALB/c小鼠,每隔2周免疫1次,共免疫3次,以注射PBS、空载体Bacmid和PEDV商业疫苗为对照组,于首免后不同时间采集血液分离其血清,ELISA法检测血清中PEDV特异性抗体的水平;于首免后35 d剖取小鼠脾脏,分离其淋巴细胞;PEDV刺激后,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖情况。【结果】PCR扩增获得了约738 bp的PEDV S1-NTD基因;成功构建了重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD、重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD和重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。利用杆状病毒表达系统在sf9细胞内成功表达了重组PEDV S1-NTD蛋白,且杆状病毒以MOI为1感染sf 9细胞后在第3天蛋白表达量达到最高。在首免后35 d,重组杆状病毒免疫组小鼠血清效价达到最高值,为1∶5 000,与商业疫苗组效价一致;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD免疫组小鼠脾淋巴细胞对PEDV的刺激也发生了显著增殖(P0.05)。【结论】成功构建了重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD,在昆虫细胞中成功表达了PEDV S1-NTD蛋白,且具有较好的免疫原性。

[目的]通过给母猪口服表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的重组枯草芽胞杆菌以评估其产生的乳源性免疫力,从而为仔猪提供相应的保护。[方法]分别给母猪口服2 mL重组枯草芽胞杆菌(1×10~9 CFU·mL~(-1))和肌肉注射2 mL灭活PEDV疫苗(1×10~7 TCID_(50)·mL~(-1)),产后1 d收集相应的样品。首先检测了乳汁中特异性SIgA及乳汁细胞中特异性IgA,然后对口腔和鼻腔分泌物中特异性SIgA和细胞因子(INF-γ和TGF-α)的水平进行了检测;最后评估乳汁中的中和抗体滴度。[结果]口服重组枯草芽胞杆菌后乳汁中SIgA及其乳汁细胞中IgA特异性抗体水平显著提高(P<0.05,P<0.01),同时乳汁及其乳汁细胞中INF-γ和TGF-α的水平也显著提高(P<0.05,P<0.01);鼻腔和口腔分泌物中特异性SIgA显著增加(P<0.05,P

为建立猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法，根据ＧＥｎ Ｂａｎｋ中公布的ＰＥＤＶ变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株的Ｓ基因和ＯＲＦ３基因，设计合成２对特异性扩增引物，用以扩增ＰＥＤＶ Ｓ基因和ＯＲＦ３基因，通过目的片段的数量和片段大小来判断ＰＥＤＶ的毒株类型；通过对退火温度等反应条件的优化，建立了检测不同ＰＥＤＶ毒株类型的多重ＲＴ－ＰＣＲ鉴别检测方法。结果显示，所建立的多重ＲＴ－ＰＣＲ鉴别检测方法能特异性区分ＰＥＤＶ变异毒株、经典毒株和弱毒疫苗株；ＰＥＤＶ变异毒株扩增出２条目的条带，分别为２３４ ＢＰ的ＯＲＦ３基因片段和８２６ ＢＰ的Ｓ基因片段；ＰＥＤＶ经典毒．．．

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白(rN蛋白)为抗原,初步建立了检测PRRSV抗体的rN-ELISA方法。根据GenBank公布的PRRSV VR2332株编码核衣壳蛋白的ORF7基因序列设计合成了一对引物,成功扩增出ORF7基因。将其克隆到PET-30a构成原核表达载体,转化宿主菌BL21(DE3)并获得表达。通过SDS-PAGE和Western blot检测证实rN蛋白获得了高效表达,且具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA法。试验证明,该方法与IDEXX公司生产的PRRSV抗体检测ELISA试剂盒对同批临床血清样本的检测结果完...

【目的】建立基于N与GP5蛋白抗原表位串联的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体ELISA检测方法,为开发准确、廉价的PRRSV抗体检测试剂盒奠定基础。【方法】将PRRSV的N蛋白和GP5蛋白抗原表位串联优化后进行原核表达,以表达的目的蛋白为抗原,通过优化反应条件建立检测PRRSV抗体的ELISA方法,对其特异性、重复性进行检测。用建立的间接ELISA方法和商品化IDEXX试剂盒同时对临床送检的45

【目的】利用RT-PCR技术建立一种在临床上便于区分猪流行性腹泻病毒(PEDV)自然感染与疫苗免疫毒株的方法。【方法】根据GenBank公布的PEDV ORF3基因序列,在其存在基因缺失区两端的保守区域设计特异性引物,对近两年采集的仔猪腹泻样品进行检测,分析流行毒株的ORF3基因,选择部分阳性样品利用鉴定引物进行RT-PCR扩增,优化其反应体系、Tm值等条件,进行鉴别诊断方法的特异性、敏感性试验,并对大量临床样品进行检测验证。【结果】从新发仔猪腹泻临床样品中克隆获得了11株PEDV的ORF3基因,序列分析显示新分离的9株ORF3基因不存在缺失,属于自然感染野毒,其与疫苗株的核苷酸同源性为95....

【目的】原核表达小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)的N蛋白,并以N蛋白为包被抗原建立血清间接ELISA检测方法。【方法】克隆PPRV N蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a中进行重组N蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化复性,并进行Western-blot鉴定。用复性后的N蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清中PPRV抗体水平的间接ELISA检测方法,并对其进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后用该方法对临床样品进行检测,检验其应用效果。

[目的]本试验旨在建立一种口服免疫的评价方法。[方法]应用灭活猪流行性腹泻病毒(PEDV)口服免疫5日龄仔猪,通过间接酶联免疫吸附试验(iELISA)检测免疫后28 d仔猪唾液、小肠黏液、大肠黏液、粪便及血清中特异性分泌型IgA(SIgA)抗体水平,采用空斑减少中和试验和荧光定量PCR(qPCR)方法评价消化道不同部位黏液抗PEDV水平,最后通过Spearman相关系数法分析比较消化道不同部位SIgA水平的相关性。[结果]小肠中特异性SIgA水平较高,大肠次之,而唾液和粪便均低于肠道中SIgA水平,且唾液、粪便和血清中SIgA水平与肠道中SIgA水平具有显著相关性;仔猪消化道不同部位的黏液具有一定抗病毒作用。[结论]首次证明仔猪口服免疫后消化道各段黏膜中SIgA水平的相关性,提示检测唾液、粪便和血清特异性SIgA水平可以评估猪群中口服PEDV的效果,为建立口服免疫评价方法提供试验依据。

【目的】建立一种快速检测猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)野毒抗体的方法。【方法】参照已发表的PPV基因组(AY502114.1)序列设计合成特异性引物,利用PCR扩增PPV NS1基因主要抗原区域,将目的片段定向克隆至表达载体pET30a(+),转化BL21(DE3)表达菌,用IPTG诱导表达重组蛋白。以该蛋白作为诊断抗原,经过对间接ELISA条件的优化,建立检测PPV抗体的NS1-ELISA诊断方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行检测。用建立的PPV NS1-ELISA诊断方法和血凝抑制试验(HI)同时对临床送检的306份血清样品进行检测,比较二者的符合率。【...

猪流行性腹泻病毒已经成为猪肉产业最近需要面对的一个主要问题。加拿大的Doug MacDougald博士已经开始研究该病毒的预防。根据2014年Banff猪肉研讨会上一名加拿大兽医的发言,美国母猪30%~40%已经感染猪流行性腹泻病毒(PED)。在这名兽医发言后,加拿大报道了在安大略省一个母猪存栏500头的育肥猪场中发现

猪流行性腹泻是一种急性、接触性、高度传染性消化道疾病,近年来给我国养猪业带来巨大经济损失。本文就近年来国内外对猪流行性腹泻病毒的研究进展(包括猪流行性腹泻病毒的结构蛋白和非结构蛋白、病毒的细胞培养特点、病毒感染的宿主受体、遗传变异和疫苗的开发等)进行综述,以期为猪流行性腹泻的预防和控制提供帮助。