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[期刊] 华北农学报
[作者]
吕翠 马小明 尹燕博 单虎
以地高辛(DIG)标记猪流感病毒(SIV)M基因的保守片段制成核酸探针,与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的cDNA、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的DNA、猪瘟病毒(CSFV)cDNA、猪伪狂犬病(PRV)的DNA进行斑点杂交,以检测探针的特异性,结果该探针仅与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA杂交呈阳性,与其余病毒杂交呈阴性;敏感性试验显示,探针最低能检出约5 pg的H3亚型的SIV RT-PCR产物。应用该探针对35份疑似SI临床病料进行检测,结果检出9份阳性,与RT-PCR检测结果一致。本研究结果表明,建立的DIG标记的核酸探...
关键词：
地高辛标记的核酸探针 猪流感病毒 检测
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
孔繁德 陆承平
将含有犬细小病毒2.0 kb DNA 克隆片段的重组质粒 pBI-264转化大肠杆菌 JF-803,扩增后用碱裂解法提取重组质粒,纯化后电泳,用冷榨法回收克隆片段。用光敏生物素分别标记重组质粒及克隆片段,制成重组质粒探针及克隆片段探针两种核酸探针,它们对犬细小病毒有相同的杂交特异性,检测灵敏度达 pg 水平,保存期至少8个月。检测25份犬粪样,阳性率为32%(8/25),而 HA-HI 试验为24%(6/25),两种方法的符合率为92%(23/25)。本试验从粪样直接提取病毒 DNA,用非放射性的光敏生物素标记探针检测,方法简便,可直接应用于兽医病毒学诊断。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
颜世敢 朱丽萍 张玉忠 周百成 张秀美 李雁冰
用适宜摩尔浓度的异型双功能交联剂SPDP将R-藻红蛋白与纯化的禽流感病毒H9亚型多克隆抗体交联,并经高效液相色谱纯化制备R-藻红蛋白标记抗体荧光探针。以溴化氰活化的琼脂糖微球为固相载体,采用双抗体夹心法建立固相免疫荧光检测法,以制备的R-藻红蛋白标记抗体荧光探针检测禽流感病毒H9尿囊毒。结果表明,阳性微球在蓝、绿光激发下发射桔黄色荧光,荧光明亮,无背景光干扰,特异性好,灵敏度高,可检测蛋白浓度为1.85×10-5mg.mL-1的H9亚型尿囊毒。R-藻红蛋白标记探针的检测灵敏度高于FITC标记探针,R-藻红蛋白可替代FITC或与FITC等荧光染料一起用于多色荧光免疫检测。
[期刊] 水产学报
[作者]
高风英 叶星 白俊杰 吴锐全 劳海华 简清 罗建仁
Probes are essential for study of gene expression and regulation. In this study, a method was established to prepare the biotin-labeled probe for 18S rRNA gene of freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii. And the labeled method was used to produce a lysozyme gene probe, then applied in analysis o...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王艳艳 鄢明华 李秀丽 张丽 孙英峰 常维山
根据GeneBank中流感病毒H1N1亚型M基因和NS基因序列,分别设计扩增M基因和NS基因的特异性引物,采用RT-PCR方法扩增猪流感病毒天津株M基因和NS基因,分别将RT-PCR产物克隆至pMD18-T载体,进行序列测定和分析。结果显示M基因全长1027 bp,其核苷酸序列与参考毒株间的同源性在85.8%~99.7%,NS基因全长890 bp,与参考毒株之间的核苷酸序列同源性在80.7%~99.2%。M和NS基因的系统发育树显示:TJ2、TJ4株与我国香港、上海和广东H1N1亚型猪流感病毒属同一分支,但与上海、广东分离株的亲缘关系更近;与2009年全球流行的人甲型H1N1流感病毒变异株和部...
[期刊] 水产学报
[作者]
邓敏 何建国 吕玲 左涛 龙綮新 陈兆明
通过分离纯化白斑综合症病毒 (WSSV)粒子 ,抽提病毒DNA ,用限制性内切酶EcoRⅠ或SalⅠ酶切后 ,克隆入质粒pBluescriptⅡKS中 ,从而建立了WSSV部分基因组文库。估计WSSV基因组DNA在16 5kb以上。将WSSVEcoRⅠ克隆片段标记制备为探针 ,进行Southern杂交、打点杂交和原位杂交 ,其结果证明了克隆片段对WSSV特异 ,并为检测WSSV提供了方法。通过对部分基因组文库序列分析发现 ,WSSV核酸序列与已知杆状病毒核酸序列的同源性低 ,与GenBank中已有病毒核酸序列比较都无较大同源性 ,说明WSSV不属于杆状病毒科 ,目前只能列为未分类的无脊椎动物病...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
陈红英 李新生 崔保安 杨明凡 金钺 刘金朋
根据GenBank公布的猪细小病毒VP2基因序列,利用Premier express软件设计并合成了1对引物和1条相应的TaqMan探针,从猪细小病毒感染的PK-15细胞中提取DNA,经PCR扩增VP2基因,纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体中,构建重组质粒.转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为荧光定量PCR标准品模板建立标准曲线.在25μL扩增反应体系中,对探针浓度、引物浓度、镁离子浓度和退火温度进行优化,建立了最佳的荧光定量PCR反应体系和扩增程序.该方法能够特异、定量检测猪细小病毒,灵敏度达1.12TCID50/mL.
关键词：
猪细小病毒 检测 实时荧光定量PCR
[期刊] 中国水产科学
[作者]
杨冰 黄倢 宋晓玲 史成银 刘莉 刘庆慧
利用非放射性标记物地高辛(DIG),通过PCR方法制备了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)DNA探针,探针长度705bp,标记产量为20ng/μL。通过核酸探针斑点杂交检测方法对此探针特异性及灵敏度进行验证,结果表明,该探针具有较高的灵敏度和较强的特异性,检测IHHNVDNA的检出灵敏度为24.8pg,可检出26.6ng患病对虾组织DNA中的IHHNV,与250.4ng健康虾组织DNA、202.5ng健康虾匀浆液,白斑综合症病毒(WSSV)DNA和肝胰腺细小病毒(HPV)DNA均不发生交叉反应。本方法可应用于健康亲虾、苗种的培育和无特定病原(SPF)对虾种群的选育及IHHNV流行病...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
蔡伟光 习欠云 肖敏 关立增 孟繁明 束刚 朱晓彤 江青艳 吴珍芳 张永亮
【目的】探索慢病毒与精子共孵育的方法,并制备转基因猪。【方法】采用正交试验分析精子密度、病毒量、精子与慢病毒共孵育时间、精子与慢病毒共孵育温度对精子活力的影响,采用PCR和Southern blotting检测转基因。【结果】①优化慢病毒与精子共孵育条件为:100μL慢病毒原液(5×105cfu)与1.0×107个/mL精子在17℃下孵育30 min;②与病毒孵育后的精子(109个/mL)给母猪人工授精时,经PCR检测49头仔猪中有14头呈阳性;③Southern blotting结果表明,8头PCR阳性仔猪中,4头融合了外源基因。【结论】优化了精子与慢病毒共孵育的条件(100μL慢病毒原液(...
关键词：
慢病毒 精子介导转基因 转基因猪
[期刊] 西南农业学报
[作者]
赵朴 郑玉姝 贾贝贝 乔传玲 陈化兰 刘兴友 李海燕
本研究通过RT-PCR扩增了猪流感病毒A/Swine/Inner Mongolia/547/01(H3N2)的NP基因,并将其克隆入pMD18-T载体。重组pMD18-T经SalI和EcoR I酶切后得到的NP基因插入pMelBacB载体的SalI/EcoRI位点。PCR和限制性内切酶分析鉴定表明成功构建了pMelBacB-NP转移载体。这为开发NP诊断抗原和亚单位疫苗奠定了基础。
关键词：
猪流感病毒 NP基因 克隆 转移载体
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
赵丹 邱冬 韩德敏 刘永杰
[目的]为减少鼠源单克隆抗体的异源性在犬临床治疗中引起的宿主免疫排斥反应,针对H_3N_2亚型犬流感病毒(CIV),制备具有犬源抗体恒定区基因(Fc)的鼠/犬嵌合抗体。[方法]从产生具有良好中和活性CIV单抗的鼠源杂交瘤细胞株中扩增抗体重链和轻链可变区基因,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得单链抗体基因(scFv)片段,同时从犬外周血单核细胞中扩增得到犬源抗体Fc片段;分别构建单链抗体与嵌合抗体表达载体,通过大肠杆菌表达、纯化后调整蛋白浓度为1 mg·mL~(-1),检测单链抗体与嵌合抗体的ELISA和血凝抑制(HI)效价,并分析其对病毒感染细胞的中和活性。[结果]获得的H_3N_2亚型CIV鼠源scFv的相对分子质量为45×10~3,ELISA及HI效价分别为1∶640(1.56μg·mL~(-1))和1∶160(6.25μg·mL~(-1)),中和效价为1∶160(6.25μg·mL~(-1));鼠/犬嵌合抗体scFv-Fc的相对分子质量为80×10~3,ELISA及HI效价分别为1∶2 560(0.39μg·mL~(-1))和1∶640(1.56μg·mL~(-1)),中和效价为1∶40(25μg·mL~(-1))。[结论]成功制备了H_3N_2亚型CIV鼠/犬嵌合抗体,为犬流感的临床治疗提供了物质基础。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
周凤丽 简纪常 吴灶和
从基因库中获取溶藻弧菌的胶原蛋白酶基因序列和外膜蛋白基因序列,根据基因的保守性用DNAStar分别设计2对引物,分别对溶藻弧菌基因组进行PCR扩增,用地高辛标记扩增的特异DNA片段以制备探针。分别用胶原蛋白酶DNA探针和外膜蛋白DNA探针对实验室保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌进行斑点杂交检测,检测结果表明,胶原蛋白酶基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应,而与霍乱弧菌、哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA等均无反应,表明该胶原蛋白酶DNA探针的特异性较强;而外膜蛋白基因探针与保种的溶藻弧菌以及鱼排分离的溶藻弧菌DNA产生较强的阳性反应,但与哈氏弧菌和副溶血弧菌DNA...
[期刊] 水产学报
[作者]
王印庚 张凤萍 李胜忠 陈霞 崔玉龙
腐皮综合征是近年来养殖刺参发生的严重疾病。发病时,刺参大批死亡,经济损失惨重。以其主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)DNA为模板,PCR扩增出16S-23S核糖体RNA基因间隔区序列,插入pMD19-T,转化大肠杆菌DH5α并测序。根据该间隔区序列,设计引物扩增177 bp的地高辛标记的探针。该探针对灿烂弧菌呈现特异性,而对其它细菌V.fluvialis,V.anguillarum,V.alginolyticus,Aeromonas hydrophila,V.harveyi,V.parahaemolyticus,V.vulnificus均呈阴性。探针对灿烂弧菌DNA的检出...
[期刊] 华北农学报
[作者]
鄢明华 李秀丽 韩伟 高荣玲 申树权 陈龙宾 侯俊辉 王东
用SPF鸡胚从2005-2006年采集自天津地区猪群样品中分离出3株猪流感病毒,测定了分离病毒的部分理化特性和生物学特性。3个猪流感病毒分离株均能凝集1%鸡红血球,将其制成琼脂扩散抗原与猪流感标准阳性血清反应均出现清晰白色沉淀线;经中国动物卫生与流行病学中心系统鉴定,3个毒株均为H1N1亚型,分别命名为A/Swine/Tianjin/TJ2/2005(H1N1)、A/Swine/Tianjin/TJ3/2005(H1N1)、A/Swine/Tianjin/TJ4/2006(H1N1)株。这3株病毒都为热不稳定型,60℃作用10 min即可使病毒失去感染能力,病毒对酸性环境(pH3.0)和乙醚均...
关键词：
猪流感病毒 H1N1亚型 分离鉴定
[期刊] 西南农业学报
[作者]
高淑霞 王文志 张伟
根据猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)H1N1、H3N2、H5N1和H9N2亚型的血凝素(HA)基因序列,分别设计各亚型的特异引物,并根据A型流感病毒的M基因序列设计引物,作为4种病毒亚型的通用引物。应用RT-PCR分别扩增各病毒亚型HA基因的特异片段和M基因片段,并克隆到pMD19-T Simple Vector构建重组质粒,经测序后,用于各病毒亚型探针的制备。将各探针按一定的阵列点加到硝酸纤维素膜上,制备成低密度基因芯片。在多重PCR过程中,用生物素标记的dUTP(Bio-11-dUTP)对待检样品进行标记,扩增产物与制备的基因芯片进行杂交,最后用扫描仪进行读...
关键词：
猪流感病毒 基因芯片 多重PCR 杂交
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