根据猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)H1N1、H3N2、H5N1和H9N2亚型的血凝素(HA)基因序列,分别设计各亚型的特异引物,并根据A型流感病毒的M基因序列设计引物,作为4种病毒亚型的通用引物。应用RT-PCR分别扩增各病毒亚型HA基因的特异片段和M基因片段,并克隆到pMD19-T Simple Vector构建重组质粒,经测序后,用于各病毒亚型探针的制备。将各探针按一定的阵列点加到硝酸纤维素膜上,制备成低密度基因芯片。在多重PCR过程中,用生物素标记的dUTP(Bio-11-dUTP)对待检样品进行标记,扩增产物与制备的基因芯片进行杂交,最后用扫描仪进行读...

用SPF鸡胚从2005-2006年采集自天津地区猪群样品中分离出3株猪流感病毒,测定了分离病毒的部分理化特性和生物学特性。3个猪流感病毒分离株均能凝集1%鸡红血球,将其制成琼脂扩散抗原与猪流感标准阳性血清反应均出现清晰白色沉淀线;经中国动物卫生与流行病学中心系统鉴定,3个毒株均为H1N1亚型,分别命名为A/Swine/Tianjin/TJ2/2005(H1N1)、A/Swine/Tianjin/TJ3/2005(H1N1)、A/Swine/Tianjin/TJ4/2006(H1N1)株。这3株病毒都为热不稳定型,60℃作用10 min即可使病毒失去感染能力,病毒对酸性环境(pH3.0)和乙醚均...

【目的】验证斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒的易感性,测定斑鸠呼吸道上皮细胞表面流感病毒受体的类型和分布。【方法】以5×104EID50/只的剂量经滴鼻、点眼途径感染A/Chicken/Beijing/2/2009(H9N2)亚型禽流感病毒,共感染8只斑鸠和8只SPF鸡,对试验斑鸠和SPF鸡进行临床症状、大体病变、组织学病变的观察及病毒抗原的定位、病毒分离和感染抗体的测定。【结果】攻毒后5d,斑鸠和SPF鸡未见异常临床表现和大体病变,病理组织学检查发现斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞均有不同程度的脱落;在斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞的胞浆内检测到了大量阳性流感病毒蛋白颗粒;斑鸠...

【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,将其亚克隆入质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有H3HA及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP。利用脂质体转染方法将穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成...

以地高辛(DIG)标记猪流感病毒(SIV)M基因的保守片段制成核酸探针,与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的cDNA、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的DNA、猪瘟病毒(CSFV)cDNA、猪伪狂犬病(PRV)的DNA进行斑点杂交,以检测探针的特异性,结果该探针仅与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA杂交呈阳性,与其余病毒杂交呈阴性;敏感性试验显示,探针最低能检出约5 pg的H3亚型的SIV RT-PCR产物。应用该探针对35份疑似SI临床病料进行检测,结果检出9份阳性,与RT-PCR检测结果一致。本研究结果表明,建立的DIG标记的核酸探...

从河南省有呼吸道症状的5个不同猪场采集棉拭子和肺组织样品。样品处理后,通过尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚。获得3株病毒,经血凝和血凝抑制试验鉴定,为H3N2亚型流感病毒,并对其部分生物学特性进行了研究。结果表明,其半数鸡胚感染量(EID50)分别是0-9.56/0.2mL,10-8.56/0.2mL和10-8.44/0.2mL,对小白鼠的半数致死量(LD50)分别是10-1.56/0.1mL,10-1.45/0.1mL和10-1.50/0.1mL;它们的血凝素对热不稳定,能凝集1%马、牛、驴、猪、绵羊、鸡、兔、豚鼠、小白鼠及人O型血的红细胞。这为了解河南猪群中流行的流感病毒奠定了基础。

【目的】建立猪瘟病毒(CSFV)、高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)及猪细小病毒(PPV)的基因芯片检测方法,为这4种病的实验室诊断和流行病学调查提供一种快速、高效的病原学诊断方法。【方法】根据GenBank中CSFV、高致病性PRRSV、PCV-2、PPV的相关基因序列,设计合成相关引物,采用PCR方法得到具有荧光标记的PCR产物,然后与含有特定检测探针的芯片进行杂交,建立其基因芯片检测方法,并对该方法的灵敏性和重复性进行检测。应用建立的基因芯片检测方法,对150份临床样品进行检测。【结果】建立了针对CSFV、PRRSV、PCV-2和PPV 4种病毒的基因芯片检...

【目的】对H9N2亚型猪流感病毒NS1(nonstructural protein1)基因进行原核表达,获得纯化表达产物,以期为检测猪流感抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增了猪流感病毒(H9N2)的NS1基因,将其克隆于表达载体pET-28a(+)上构建成重组质粒pET-NS1,转化受体菌E.coliBL21-DE3感受态细胞,经酶切鉴定及序列分析,筛选出正确重组质粒转化子。【结果】经终浓度5mmol·L-1乳糖诱导,SDS-PAGE电泳结果显示,重组蛋白NS1得到大量表达,分子质量约为26kD。经Western-blotting分析,表达蛋白能与阳性血清发生特...

根据GeneBank中流感病毒H1N1亚型M基因和NS基因序列,分别设计扩增M基因和NS基因的特异性引物,采用RT-PCR方法扩增猪流感病毒天津株M基因和NS基因,分别将RT-PCR产物克隆至pMD18-T载体,进行序列测定和分析。结果显示M基因全长1027 bp,其核苷酸序列与参考毒株间的同源性在85.8%~99.7%,NS基因全长890 bp,与参考毒株之间的核苷酸序列同源性在80.7%~99.2%。M和NS基因的系统发育树显示:TJ2、TJ4株与我国香港、上海和广东H1N1亚型猪流感病毒属同一分支,但与上海、广东分离株的亲缘关系更近;与2009年全球流行的人甲型H1N1流感病毒变异株和部...

【目的】了解广西H9N2亚型猪源流感病毒的分子流行病学特征并揭示其遗传变化规律,为有效防控猪流感提供参考依据。【方法】运用PCR方法扩增广西2株H9N2亚型猪源流感病毒(A/swine/Guangxi/P2/2011和A/swine/Guangxi/P3/2011)的HA基因,并进行克隆测序及序列比对分析,绘制遗传进化树。【结果】2株H9N2亚型猪流感分离株的HA基因全长1701 bp,开放阅读框(ORF)全长1683 bp,编码560个氨基酸;与参考毒株核苷酸的同源性在83.7%～98.3%,推导氨基酸同源性在86.6%～98.2%。遗传进化树分析结果显示,2株分离株与A/Duck/HongKong/Y280/97病毒同属欧亚谱系的Y280亚系,其HA基因的裂解位点序列均为RSSR↓GLF,具有低致病性流感病毒的分子生物学特征;共有8个糖基化位点,其中6个位于HAl区,2个位于HA2区;HA受体结合位点均具有人流感病毒和猪流感病毒特征。【结论】分离获得的广西2株H9N2亚型猪源流感病毒A/Swine/Guangxi/P2/2011和A/Swine/Guangxi/P3/2011,其HA基因属于欧亚普系的Y280亚系,均具备典型的低致病性和与人流感受体结合特征。

【目的】在云南生境下挖掘甘蓝型油菜含油量QTL位点,为高含油量性状遗传机制研究和分子标记辅助高含油量育种提供理论基础。【方法】以高含油量材料G28为母本,低含油量材料H008为父本,通过小孢子培养技术创建包含175份株系的F_1 DH群体,利用60K SNP芯片构建高密度遗传连锁图谱,结合2016-2017年丽江与临沧点DH群体含油量数据采用完备区间作图法,以LOD=2.5为阈值扫描含油量性状QTL。【结果】DH群体含油量性状呈现正态分布,表现出单向超亲分离。2个环境下共检测到6个含油量QTL,分别可解释6.29%～10.36%的表型变异。通过Blast分析将这6个QTL分别映射到参考基因组-Darmor-bzh ChrA01,ChrA10,ChrC05与ChrC08染色体物理图谱上。与前人研究比较分析推测位于C05染色体上的qOCc05.1与qOCc05.2为新的含油量性状相关的QTL。【结论】在云南生境下检测到6个含油量性状QTL并明确了其在染色体的物理区间,定位结果可用于下一步主效QTL的精细定位和分子标记辅助高含油量油菜育种。

根据禽流感病毒(AIV)的M基因序列设计合成了1对AIVM基因的通用诊断引物AMDI／AMD2,针对H5N1、H9N2两种亚型的HA基因分型设计合成了2对分型诊断引物H15D1／H5D2,H9D1／H9D2。采用一步法多重RT-PcR技术建立了一种禽流感病毒快速分型诊断方法,并对其特异性和灵敏度进行验证。结果表明,该诊断方法速度快,一般只需要28～30 h即可鉴定出结果,比病毒分离鉴定(5～7 d)至少缩短4～6 d;特异性强,试验组53株AIV全部扩增出与预期同样长度的目的条带,与病毒分离及血清学鉴定方法的检测结果完全一致。对照组中新城疫病毒(NDV)、减蛋综合征病毒(EDS76V)、传染性...

【目的】探讨自行研制的由贯众、板蓝根、黄芪、柴胡、连翘、黄连、金银花、黄芩及甘草配制的复方中药在体内、体外对禽流感病毒的抑制作用、药物代谢动力学、急性毒性试验及对SPF鸡免疫功能的影响。【方法】在鸡胚、MDCK细胞上进行复方中草药对H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的直接灭活作用、治疗作用和预防作用;在体内通过药物累计法研究复方中药在昆明鼠体内的药物代谢动力学;采取口服和腹腔注射两种给药途径研究复方中药对昆明鼠的急性毒性试验;通过免疫器官的指数、在FAC上测量CD3+、CD4+、CD8+及TCR+的含量及采用血凝抑制(HI)方法检测血清中H9亚型禽流感抗体滴度研究复方中草药的对SPF鸡免疫功能的...

【目的】了解猪流感病毒的分子流行病学,为动物流感的防控提供科学依据。【方法】将猪的鼻拭子接种鸡胚进行病毒分离,对血凝试验阳性的样品在SPF鸡胚上进一步纯化、增殖,采用RT-PCR对分离毒株的全基因组进行扩增,使用Applied Biosystems 3500x L Genetic Analyzer进行序列测定,利用DNASTAR软件对测序基因片段进行整个阅读框的核苷酸序列同源性比对分析,并用MEGA 6.0绘制遗传进化树及分析氨基酸位点。【结果】分离毒株A/swine/Zhejiang/245/2013(SW/ZJ/245/13)为H1N1亚型病毒,核苷酸的分析结果发现该分离毒株的8个基因片段...

【目的】流感病毒的致病性是由多个基因共同决定的，笔者之前的研究结果发现当两株具有相似基因特征的H1N1亚型猪流感病毒进行HA基因替换以后，病毒对小鼠的致病性发生了改变。通过确定影响病毒致病性的关键氨基酸位点，为进一步揭示流感病毒致病力差异奠定了基础。【方法】对ZD71和SY130的HA蛋白氨基酸序列进行比对，确认氨基酸差异位点并设计定点突变引物，构建单点突变的重组病毒并测定其鸡胚半数感染量（EID50）。将拯救的亲本病毒、HA单基因替换重组病毒及单点突变重组病毒以感染复数（MOI）为0.001和0.1的病毒量分别接种于MDCK和A549细胞，测定病毒的体外复制能力；将上述各株病毒以50μL含106EID50的剂量经滴鼻途径接种BALB/c小鼠，分别采集小鼠的脑、鼻甲、肺、脾、肾等脏器，匀浆处理后接种鸡胚分析病毒在小鼠体内各脏器的复制情况；将病毒分别以50μL含101-106 EID50的剂量经鼻腔感染BALB/c小鼠，感染后每天称量小鼠体重，当小鼠体重下降比率超过25%时判定为死亡，统计死亡情况，测定病毒的小鼠半数致死量（MLD50），评估各突变病毒对小鼠的致病性，与亲本病毒进行分析比较后，获知决定病毒致病性的关键氨基酸位点。【结果】ZD71和SY130病毒HA蛋白共存在4个氨基酸差异位点，分别为4、138、144和225位（H3 Numbering）。经过定点突变、病毒拯救及序列测定确认，分别获得含有单个位点突变的重组病毒。通过测定病毒在MDCK和A549细胞上的复制情况，结果发现与亲本病毒rZD71相比较，突变病毒rZD71-HA/G225E在感染MDCK细胞的各检测时间点、及感染A549细胞24—48 h后，复制滴度均显著提高；与rSY130相比较，突变病毒rSY130-HA/E225G在感染MDCK细胞12—36 h后、及感染A549细胞36—72 h后，复制滴度均显著降低。而4、138、144位点的突变对病毒的复制影响较小。进一步的小鼠感染试验发现HA 225位氨基酸的改变显著影响了病毒对小鼠的致病性，与亲本病毒rZD71相比，225位氨基酸由G突变为E后，病毒rZD71-HA/G225E的MLD50由4.32 log10EID50降低至3.0 log10EID50；病毒不仅在小鼠鼻甲和肺脏内检测到，而且在脾脏和肾脏中也均有一定水平的复制。【结论】HA蛋白225位氨基酸对两株H1N1 SIV对小鼠的致病性具有重要决定作用，提示在后续开展的病原学监测中要密切关注该位点氨基酸的变异情况，为更好地防控动物流感乃至人流感的大流行提供科学依据。