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[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
温立斌 何孔旺 杨汉春 倪艳秀 吕立新 张雪寒 茅爱华
根据GenBank中的猪抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞中扩增和克隆了PKR、OAS/RNase L及Mx的101 bp核苷酸片段。测序鉴定后,将重组质粒10倍系列稀释后作为标准模板,通过实时荧光定量PCR方法,建立了抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx标准曲线及其直线回归方程;该方法具有线性关系好,特异性、敏感性、重复性高等特点;建立的荧光定量PCR方法可检测抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx mRNA水平。为猪体内抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx的mRNA水平的定量检测提供必要...
[期刊] 华北农学报
[作者]
温立斌 何孔旺 杨汉春 郭容利 李成仁 卢维彩 贾付从
依据GenBank登录的猪Th1型细胞因子(IL-2、IL-12、IFN-γ)、Th2型细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)的核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞中扩增和克隆了上述因子的101 bp核苷酸片段。测序鉴定后,将重组质粒10倍系列稀释后作为标准模板,通过实时荧光定量PCR方法,建立了它们各自的标准曲线及直线回归方程。结果表明,该方法具有线性关系好,特异性、敏感性、重复性高等特点,为猪体内IL-2、IL-12I、FN-γ、IL-4、IL-6和IL-10的mRNA水平的定量检测,提供了必要的技术手段。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
乔俊文 苏晓鸥 赵德明 李玉荣 王伊琴
为实时相对荧光定量PCR检测绵羊组织中朊病毒受体LRP/LRmRNA表达水平,构建目的基因LRP/LR、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线;根据GeneBank中绵羊37 kD/67 kDLRP/LR(LRP/LR)和β-actin基因编码区保守序列,设计特异引物;提取肠道组织mRNA,经反转录RT-PCR扩增,产物回收纯化后,与pGEM-T-easy载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α;质粒提取后经酶切、PCR和测序鉴定后,获得阳性LRP/LR,β-actin重组质粒;将阳性重组质粒107~102梯度稀释作为模板,然后进行实时荧光定量PCR;系统软件自动生成标准曲线及回归方程。结...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
张太翔 宁章勇 赵德明 周向梅 杨建民 尹晓敏
为阐释PrP基因在奶牛生殖系统的正常表达和正常的生理功能,以及为确定生殖系统在疯牛病垂直传播中的地位和其分子机理奠定基础,采用实时荧光定量RT-PCR的方法构建了奶牛生殖系统PrP基因的标准质粒和标准曲线。对含有目的基因质粒的EcoRⅠ酶切鉴定表明所插入的片段大小为302 bp,与预期的结果一致。所构建的标准曲线的相关系数r2=0.999,系统生成的回归方程为y=-0.29x+9.48,说明成功构建了奶牛生殖系统PrP基因的标准质粒和标准曲线,为研究PrP基因在奶牛其他组织的定量奠定基础。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
邵玲 汤茜 张海强
Rhbdd3(Rhomboid domain-containing protein 3)蛋白在哺乳动物天然免疫中发挥了重要作用,但水生动物中rhbdd3基因的确定序列及Rhbdd3蛋白的功能均尚未见报道。为研究鲤(Cyprinus carpio)的Rhbdd3蛋白在鱼类细胞中的功能,探讨其过表达对鱼类病毒感染的影响,本研究通过PCR扩增得到了鲤rhbdd3基因的编码序列,并将其克隆至pCI-neo载体上,构建了真核表达质粒pCI-rhbdd3。pCI-rhbdd3转染鲤上皮瘤细胞EPC(epithelioma papulosum cyprinid)和鲑囊胚细胞CHSE-214(chinook salmon embryo)后利用制备的特异性抗体进行Western blot,检测Rhbdd3蛋白的表达情况,并利用CCK-8试剂检测其过表达对细胞增殖的影响。转染后分别进行鲤春病毒血症病毒(SVCV)和传染性胰腺坏死病毒(IPNV)的感染实验,并利用间接免疫荧光、Western blot和RT-qPCR方法检测Rhbdd3过表达对SVCV和IPNV增殖的影响。结果显示,pCI-rhbdd3转染后Rhbdd3蛋白在EPC和CHSE-214细胞中得到了过表达,且Rhbdd3蛋白的过表达能显著抑制SVCV和IPNV的复制,但不影响两种细胞的正常活性。本研究为鱼类广谱抗病毒药物的开发提供了新的实验依据,也为鱼类抗病毒新品种的培育奠定了重要基础。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
陈红英 李新生 崔保安 杨明凡 金钺 刘金朋
根据GenBank公布的猪细小病毒VP2基因序列,利用Premier express软件设计并合成了1对引物和1条相应的TaqMan探针,从猪细小病毒感染的PK-15细胞中提取DNA,经PCR扩增VP2基因,纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体中,构建重组质粒.转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为荧光定量PCR标准品模板建立标准曲线.在25μL扩增反应体系中,对探针浓度、引物浓度、镁离子浓度和退火温度进行优化,建立了最佳的荧光定量PCR反应体系和扩增程序.该方法能够特异、定量检测猪细小病毒,灵敏度达1.12TCID50/mL.
关键词：
猪细小病毒 检测 实时荧光定量PCR
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
修金生 吴顺意 曾新斌 陈小权
参考GenBank上的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因序列,根据其开放阅读框ORF1保守序列设计引物,建立基于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法来检测PCV2.所建立的荧光定量PCR方法最低检测限为82.2拷贝.反应-1,与常规PCR相比,灵敏度高出100倍.扩增产物的融解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,溶解温度为(85.98±0.13)℃,对猪圆环病毒1型(PCV1)、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒无扩增,可重复性好,组内变异系数为0.29%-1.35%,组间变异系数为0.96%-2.42%,检测速度快,从样本处理到报告结果得出仅需3 h....
[期刊] 华北农学报
[作者]
王进忠 王彦珺 王锡锋 张民照 高遐虹 孙淑玲 周广和
以麝香百合叶片愈伤组织为受体,利用根瘤农杆菌介导法将美洲商陆蛋白(PAP)基因和抗卡那霉素筛选基因以共转化的方式转入百合叶片愈伤组织中,然后在含有MS培养基中筛选愈伤组织并得到再生植株,在建立的农杆菌转化百合的遗传转化体系中,获得49株再生植株,经PCR检测表明PAP基因已经转移到有抗性愈伤组织再生出百合植株中。
关键词：
PAP基因 麝香百合 转化 表达
[期刊] 西南农业学报
[作者]
韩建强 许文花 高斌
根据GenBank上猪GAPDH基因的序列设计并合成一对引物,采用SYBR GreenⅠ染料建立了Real-time PCR方法。以阳性重组质粒为标准品,建立了标准曲线,并进行了融解曲线分析。结果表明,所建立的方法具有快速、高通量、线性范围广以及重复性强等特点。研究结果为GAPDH作为内参基因用于猪相关基因定量表达分析奠定了基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
罗满林 陈溥言 张林元 蔡宝祥 邓小昭
将马立克氏病病毒(MDV)GA 株基因文库中 BamH I I_3和 K_3克隆片段分别用 BamH I 加 Sal I 和 BamH I加 EcoR I 双酶切消化。含有编码 MDV 糖蛋白 B(gB)部分 DNA 的2.B kb、BamH I-Sal I 片段和1.1kb、BamH I-EcoR I 片段与 Sal I-EcoR I 消化的载体 pUR 222通过三聚体连接方式相连接。限制性核酸内切酶分析表明,重组质粒含有 MDV gB 基因,并且 MDV GA 株 gB 基因克隆在 EcoR I,Hind,Ⅲ,Xba I 和 Sal I 切点与 MDVRBIB 株相同。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
罗满林 陈溥言 张林元 蔡宝祥 邓小昭
含有马立克氏病病毒糖蛋白Ｂ基因重组质粒的改造及其鉴定罗满林，陈溥言，张林元，蔡宝祥，邓小昭（南京农业大学动物医学院，２１００９５；南京军区军事医学研究所）ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮＡＮＤＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴＰＬＡＳＭＩ...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
曹伟伟 郭抗抗 许信刚 宁蓬勃 刘伟 程敏 董玲娟 徐磊 高婉俊 任敏
【目的】建立一种能在临床上快速、准确检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中已公布的PCV-2陕西分离株的全基因序列,在PCV-2的ORF2核苷酸序列的保守区域,设计合成1条TaqMan探针和1对特异性引物;利用设计的引物扩增ORF2部分基因并鉴定后,回收PCR扩增产物,连接pMD19-T载体,转化DH5α大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定后提取质粒,作为荧光定量PCR的标准品;以标准品为模板建立检测PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价;用建立的荧光定量...
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
于静 劳秀杰 陈彦永 何小江 代兵 赵阿勇 王晓杜 宋厚辉
猪圆环病毒２型（ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ２，ｐｃｖ２），是感染猪ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ的一种单链ｄｎａ病毒。建立一种快速、灵敏的检测方法，对于ｐｃｖ２感染猪的筛选和疾病预防非常重要。根据ｐｃｖ２ ｏｒｆ２基因保守区，设计了荧光定量聚合酶链式反应（ｐｃｒ）引物，利用ｓＹＢｒ Ｇｒｅｅｎ作为荧光染料建立了一种定量检测ｐｃｖ２的ｐｃｒ方法。结果表明：该方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的优点，每微升的最低检测限低至１０１拷贝ｄｎａ。利用该方法对３４份ｐｃｖ２阳性临床样本进行检测，检测符合率为１００％，明显高于普通ｐｃｒ方法的５０．０％。因此，本研究建立的ｐｃｖ２实时．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
温立斌 何孔旺 杨汉春 郭容利 俞正玉 茅爱华 倪艳秀 张雪寒 周俊明 吕立新 李彬 王小敏
为探讨类猪圆环病毒2型因子P1感染对猪抗病毒蛋白分子mRNA转录的影响,将P1分子克隆接种30日龄健康广西巴马小型猪,利用实时荧光定量PCR技术对猪外周血单个核细胞抗病毒蛋白分子PKR、2'-5'OAS2、 RNase L和Mx1的mRNA转录水平的变化进行了定量分析。结果表明,PKR mRNA转录在接种后8 d和40 d呈上调趋势;而2'-5'OAS2 mRNA在3 d和17 d下调,Mx1 mRNA也在接种后17 d下调;RNaseL mRNA转录水平则没有发生明显变化。研究揭示P1感染猪后,机体的抗病毒蛋白的功能受到了不同程度的影响。
关键词：
P1 外周血单个核细胞 抗病毒蛋白
[期刊] 中国农业科学
[作者]
廉红霞 卢德勋 高民
【目的】克隆猪cDNA,作为猪LPLmRNA定量检测的标准品,建立检测方法。【方法】用RT-PCR,从猪背最长肌的总RNA中逆转录扩增LPL的cDNA,将纯化的LPLcDNA与pGM-T载体进行连接,转化宿主菌TOP10,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析,对质粒标准进行实时荧光定量PCR检测。纯化质粒并检测260nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。【结果】建立了猪LPLmRNA实时定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达103拷贝,线性范围为1×103～1×1010拷贝,阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(R2=0.9...
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