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[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
修金生 吴顺意 曾新斌 陈小权
参考GenBank上的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因序列,根据其开放阅读框ORF1保守序列设计引物,建立基于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法来检测PCV2.所建立的荧光定量PCR方法最低检测限为82.2拷贝.反应-1,与常规PCR相比,灵敏度高出100倍.扩增产物的融解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,溶解温度为(85.98±0.13)℃,对猪圆环病毒1型(PCV1)、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒无扩增,可重复性好,组内变异系数为0.29%-1.35%,组间变异系数为0.96%-2.42%,检测速度快,从样本处理到报告结果得出仅需3 h....
[期刊] 华北农学报
[作者]
郭慧娟 李秀丽 张国伟 鄢明华 王利丽 张莉 孙英峰
通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了一种检测PCV2的SYBR Green荧光定量PCR方法。试验结果表明,该方法特异性强,与猪1型圆环病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等均无交叉反应。该方法最低可检测到10拷贝/μL的DNA,比PCR检测方法敏感性高1 000倍;其标准曲线线性范围是6.84×102~6.84×107拷贝,且具有良好的重复性。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
贾艳艳 李明凤 王东方 崔保安 陈红英 魏战勇 吕晓丽 郭显坡
【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪圆环病毒2型(PCV2)的SYBR-Green 1实时荧光定量PCR方法。【方法】根据已报道的PCV2ORF2基因组序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR扩增PCV2ORF2基因,将鉴定正确的ORF2基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR-Green 1荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】PCV2荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.9988,最低检测的拷贝数为1拷贝/25μL,特异性...
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
于静 劳秀杰 陈彦永 何小江 代兵 赵阿勇 王晓杜 宋厚辉
猪圆环病毒２型（ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ２，ｐｃｖ２），是感染猪ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ的一种单链ｄｎａ病毒。建立一种快速、灵敏的检测方法，对于ｐｃｖ２感染猪的筛选和疾病预防非常重要。根据ｐｃｖ２ ｏｒｆ２基因保守区，设计了荧光定量聚合酶链式反应（ｐｃｒ）引物，利用ｓＹＢｒ Ｇｒｅｅｎ作为荧光染料建立了一种定量检测ｐｃｖ２的ｐｃｒ方法。结果表明：该方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的优点，每微升的最低检测限低至１０１拷贝ｄｎａ。利用该方法对３４份ｐｃｖ２阳性临床样本进行检测，检测符合率为１００％，明显高于普通ｐｃｒ方法的５０．０％。因此，本研究建立的ｐｃｖ２实时．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
李鹏 郭军庆 金前跃 李青梅 李清州 万博 王选年 王川庆 张改平
根据PCV2 ORF1设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠReal-time PCR检测方法。该方法灵敏度可达10~100拷贝/μL,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)以及猪细小病毒(PPV)没有交叉反应,利用该方法从50份临床病料中检测出43份阳性PCV2病毒,阳性检出率为94%。与常规PCR比较结果显示,该方法具有较高的灵敏度和特异性,能够快速检测和监控PCV2的感染流行。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
曹伟伟 郭抗抗 许信刚 宁蓬勃 刘伟 程敏 董玲娟 徐磊 高婉俊 任敏
【目的】建立一种能在临床上快速、准确检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中已公布的PCV-2陕西分离株的全基因序列,在PCV-2的ORF2核苷酸序列的保守区域,设计合成1条TaqMan探针和1对特异性引物;利用设计的引物扩增ORF2部分基因并鉴定后,回收PCR扩增产物,连接pMD19-T载体,转化DH5α大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定后提取质粒,作为荧光定量PCR的标准品;以标准品为模板建立检测PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价;用建立的荧光定量...
[期刊] 华北农学报
[作者]
温立斌 何孔旺 杨汉春 郭容利 周俊明 钟书霖
该研究旨在建立快速、敏感和特异的检测类猪圆环病毒因子P1的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR法,用于P1的早期诊断。以感染P1的猪血清DNA提取物为模板,采用PCR扩增P1 101 bp的基因片段,将其克隆至pMD18-T载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测。经测序证实扩增片段属于P1,所建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测P1的反应在101~108拷贝/μL之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10拷贝/μL,而对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测为阴性,表...
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
石林 吴瑗 巴少波 刘正奎 陈琳 王磊 邵春艳 孙静 周莹姗 王晓杜 宋厚辉
猪圆环病毒2型(PCV2)是一种引起仔猪Sus scrofa多系统衰竭综合征、免疫抑制、皮肤肾病综合征等疾病的病原体。根据GenBank中PCV2 ORF1基因序列设计合成特异性引物和探针,以PCV2基因组DNA为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段,并将目的片段克隆至pMD18-T载体,构建阳性标准品。以阳性标准品为模板,优化荧光定量PCR反应条件,建立标准曲线,进行灵敏性、重复性和特异性验证,并应用此方法对临床样品进行检测。结果表明:阳性质粒标准品构建成功,该检测方法的引物与探针的最佳浓度皆为0.2μmol·L~(-1),线性检测范围为2.1×10~(13)~2.1×10~6拷贝·L~(-1),最低检测限值为8.828×10~6拷贝·L~(-1),且与其他相关疾病无交叉反应;各批次检测变异系数低,检测方法稳定性好。本研究建立的敏感性高、特异性好的实时荧光定量PCR方法,为PCV2的快速检测提供了新工具。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
姜海军 陈琼 孔繁德 李国平 黄印尧 徐淑菲
参照GenBank收录的猪圆环病毒2型(PCV2)基因组全序列选择保守区域设计合成了引物及其探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqM an荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床采集的组织病料进行了检测,并与常规PCR检测方法作比较.结果显示,所建立的方法灵敏度可达3×101拷贝.μL-1,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)没有交叉反应,具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点,适合于PCV2的流行病学调查和临床诊断.
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵丽 赵绪永 陈红英 崔保安
【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒(PPV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPVVP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg2+浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量PCR反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试...
[期刊] 水产学报
[作者]
曹泽艺 周庆杰 陈凯 习丙文 谢骏 潘良坤 毛颖
为克服现有小瓜虫病的显微镜检和PCR诊断等方法在该寄生虫的感染早期阶段和环境样本检测中存在的缺陷，建立特异性强、灵敏度高的多子小瓜虫PCR检测方法，实验根据多子小瓜虫线粒体COⅠ序列设计和筛选了一对引物，经过PCR程序优化、特异性、灵敏性验证以及临床和环境样品检测分析，分别建立了普通PCR和荧光定量PCR检测方法。结果显示，本研究获得的检测引物对多子小瓜虫有较高的扩增特异性，对同属纤毛虫类的草履虫、四膜虫和肠袋虫以及常见养殖鱼类宿主异育银鲫、草鱼、尼罗罗非鱼和团头鲂等样本均无扩增；扩增特异性和灵敏度都优于文献报道的方法。其中，普通PCR最低检测的样本浓度为掠食体2.67个/μL，荧光定量PCR在掠食体0.02个/μL时依然能有效检出，荧光定量PCR检测灵敏度高于普通PCR。研究表明，在临床样本和养殖水环境样本检测应用中，基于该引物的两种PCR方法表现出很高的一致性，能有效检出潜伏感染鱼体和养殖水环境中的多子小瓜虫。本研究所建立的多子小瓜虫的检测方法特异性强、灵敏度高，适用于淡水养殖中小瓜虫病的早期诊断和病原体的检测。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨增岐 祝卫国 王旭荣 张涌
应用PCR扩增得到猪2型圆环病毒ORF2基因的3′端约600 bp,该PCV2 ORF2基因已去除终止子,并分别在其上下游添加Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点。PCR产物用Kpn Ⅰ和 Hind Ⅲ酶切后,与经同样处理过的 pBAD/g Ⅲ B Vector连接,转化TOP10细胞后挑取阳性克隆,经酶切鉴定和测序验证后用L-arabinose诱导进行融合表达,表达的蛋白主要以包涵体存在。经过镍离子亲和层析柱纯化,SDS-PAGE显示1条约28 ku的目的条带, 纯度达到85％以上。以该28 ku的多肽包被酶标板,建立了PCV2的间接ELISA检测方法。
[期刊] 华北农学报
[作者]
马鹏 李林杰 常秋燕 王悦萦 郭富城 刘萍 马晓霞 马忠仁
利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法和RT-PCR方法建立2种有效地实验室检测牛病毒性腹泻病毒的方法。根据Gen Bank中登录的牛病毒性腹泻病毒基因序列,选取14株BVDVⅠ型和7株BVDVⅡ型,经序列比对后,设计合成1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。通过对RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行检测。结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出250 bp的特异性片
[期刊] 西南农业学报
[作者]
韩建强 许文花 高斌
根据GenBank上猪GAPDH基因的序列设计并合成一对引物,采用SYBR GreenⅠ染料建立了Real-time PCR方法。以阳性重组质粒为标准品,建立了标准曲线,并进行了融解曲线分析。结果表明,所建立的方法具有快速、高通量、线性范围广以及重复性强等特点。研究结果为GAPDH作为内参基因用于猪相关基因定量表达分析奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
冯华 刘运超 陈玉梅 魏蔷 张改平
为了建立一种基于SYBRGreen的猪圆环病毒2型(PCV2)荧光定量PCR诊断方法,以PCV2 ORF2基因序列为研究对象,构建p MD19T-ORF2重组质粒作为阳性标准品,设计特异性引物,对该方法的最适引物浓度、退火进行了优化,并对该方法的灵敏度、特异性、可重复性以及临床样品检出率进行了评价。结果表明,该方法引物的最佳终浓度为0. 2 mol/L,最适退火温度为55℃;检测限可达到3. 0×10~2个拷贝/mL,而普通PCR检测限在3. 0×10~4个拷贝/mL;溶解曲线分析显示,在77~79℃有单一的溶解峰出现,并与CSFV、PPV、PRRSV、PRV没有交叉反应;组内重复性变异系数为0. 29%~0. 32%,组间变异系数为0. 32%~0. 36%;此外,该方法对临床样品的检出率为81. 5%(31/38),而常规PCR为68. 4%(26/38)。因此,相比常规PCR,该方法更为快速、灵敏、特异、稳定,更适合PCV2临床样品的检测,可为该PCV2早期感染的快速检测提供新方法。
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