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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
温立斌 张丹 何孔旺 解建平 董美响
利用无缝克隆方法构建ＺＪ－Ｒ全长基因组的单拷贝分子克隆以及双拷贝串联分子克隆；通过生物信息学技术预测ＺＪ－Ｒ病毒结构蛋白的Ｂ细胞抗原表位，人工合成选定的表位肽，然后偶联ＫＬＨ免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体；免疫组化试验证实该多抗与转染ＰＫ１５细胞的ＺＪ－Ｒ双拷贝串联分子克隆具有反应性。结果表明构建的ＺＪ－Ｒ双拷贝串联分子克隆具有感染性。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
郭龙军 陆月华 黄立平 危艳武 刘长明
【目的】中国猪群中猪圆环病毒2型(PCV2)感染存在不同基因型毒株(PCV2a、PCV2b和PCV2d),有必要阐明不同基因型PCV2毒株的致病性差异。【方法】采用感染性克隆技术构建了不同基因型代表性毒株,对拯救的毒株进行体外生物学特性试验。【结果】构建了4个不同基因型的PCV2感染性分子克隆,经转化细胞后拯救4个克隆毒株,经核酸序列分析、病毒形态学观察、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)等证实属于不同基因型的PCV2毒株;拯救的毒株均通过细胞连续传10代,病毒增殖能力稳定,毒价均可达到105.0TCID50.mL-1;用具有中和病毒活性的单克隆抗体(1D2株)进行抗原捕获ELISA检测,...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
陈美玲 陈焕春 宋云峰 黄红亮
参照Genbank上公开发表的PCV1 全基因序列设计引物,以质粒pSK PCV为模板扩增出PCV1 ORF2基因,插入pMD18 T载体,对筛选出的阳性质粒进行测序,将测序结果同Genbank上发表的PCV1 基因序列相比较,同源性达97%,再与Genbank 上发表的PCV2 的ORF2 基因序列相比较发现PCV1 ORF2 和PCV2 ORF2的差异表现在两者在核苷酸序列的2个部位互相存在基因缺失现象。将推导出的PCV1 ORF2 的氨基酸序列同PCV2 ORF2进行比较,发现二者在几个功能区相当保守,尤其是N 末端的核定位序列、N 糖基化位点以及酪氨酸磷酸化位点。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
邹兴启 赵启祖 范运峰 朱元源 王琴 徐璐 范学政 宁宜宝
【目的】建立猪瘟病毒研究技术平台,为进一步研究猪瘟病毒C株在细胞中的增殖机制及猪瘟病毒标记疫苗奠定基础。【方法】本试验以猪瘟病毒C株为研究材料,经RT-PCR扩增获得涵盖全长的6个片段,用合适的酶切位点连接,成功构建了C株全长感染性克隆pAC-CS。体外转录得到RNA,然后将其分别转染BHK-21和SK6细胞。拯救的病毒通过上清传代(常规病毒传代)和带毒细胞传毒繁殖。【结果】通过RT-PCR、免疫过氧化酶单层细胞试验和兔体发热试验检测,表明病毒拯救成功。经比较以电转的方式转染SK6的效果较好。通过带毒细胞传代,至12代时病毒滴度稳定达104TCID50.mL-1,而上清传代至第3代时用免疫过氧...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
车勇良 周伦江 王隆柏 魏宏 陈少莺 陈如敬 庄向生
【目的】制备猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Cap蛋白单克隆抗体,并对其进行鉴定和应用。【方法】以超离纯化的猪圆环病毒Ⅱ型作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,经间接ELISA筛选获得了2株分泌PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为8-60和10-48,对其生物学特性进行鉴定,并将其作为一抗,建立了间接免疫荧光诊断方法。【结果】8-60和10-48的染色体数平均为98～105对,间接ELISA检测其细胞培养上清液效价分别为1∶16和1∶32,小鼠腹水效价分别为1∶3×212和1∶3×213,抗体的免疫球蛋白亚型均为IgM。间接免疫荧光结...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张秀珊 曹洪战 张丽青 刘涛 陈赛娟 孙继国
以PCV2 PK-15细胞毒提取的DNA为模板,用PCR扩增PCV2ORF2基因的后部约600 bp片段;对PCR产物回收纯化后与载体pMD19-T进行连接、转化,经酶切和序列分析后亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-ORF2,转入大肠埃希氏菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳和Western-Blotting分析。结果表明,重组表达质粒在大肠中所表达的融合蛋白相对分子量为40 kDa,Western-blotting分析表明该蛋白具有PCV2抗原性。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
琚春梅 陈焕春 郗鑫 刘正飞 曹胜波
目的以伪狂犬病病毒为载体,构建表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组病毒,并研究其生物学特性。方法将猪2型圆环病毒ORF2基因插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体中,构建猪2型圆环病毒-伪狂犬病病毒重组中间转移质粒,然后将该质粒与伪狂犬病病毒TK-/gG-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行重组病毒的筛选及生物学特性测定。结果利用检测PCV2ORF2基因和LacZ基因的PCR方法筛选到重组病毒TK-/gG-/ORF2+,同时用Southernblotting证实外源基因PCV2ORF2已成功插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中。间接免疫荧光试验(...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王晓钧 魏丽丽 相文华 张晓燕 吕晓玲 赵立平 朱远茂 邵一鸣 沈荣显
马传染性贫血病毒(equineinfectiousanemiavirus,EIAV)驴强毒株DV是一株经过驴体传代获得的而具有超强毒力的毒株,对马和驴均可100%致死。用PCR方法分段扩增了DV其前病毒基因,将包含全基因片段的3个基因克隆以限制性内切酶消化后顺次连接克隆到pLG338上,命名为pD70344。将此克隆体外转染驴胎皮肤细胞和驴白细胞,连续盲传3代并以反转录酶活性测定,RT-PCR鉴定其病毒活性,透射电镜观察发现细胞培养物中存在大量典型病毒粒子,证明获得了1株具有感染性的EIAV病毒粒子,命名为pD70344V。经序列测定确认了本试验首次构建了1株完全来源于EIAV强毒基因的感染性...
[期刊] 华北农学报
[作者]
温立斌 何孔旺 王凤芝 俞正玉 茅爱华 解建平
类猪圆环病毒P1是新发现的一种病原,能引起仔猪出现类似猪断奶后多系统衰竭综合征症状,是目前所知的具有最小基因组的病毒。为了解P1感染范围和基因组分子特征,采用PCR方法扩增P1全基因组,克隆测序后,应用生物信息学进行序列同源性比较及遗传进化分析。结果显示,P1已在我国猪场流行,分离株之间的核苷酸序列同源性为99.1%～100%,可分为2个亚分支;同时免疫组化结果也证实了P1在样品中的分布。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
祁小乐 高宏雷 高玉龙 邓小芸 步志高 王晓燕 王笑梅
【目的】建立高效鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)拯救平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】在IBDVGt株全基因组中引入分子标签(A节段:EcoR V酶切位点;B节段:PstI酶切位点)。在基因组两端分别引入锤头状核酶结构(HamRz)和丁肝病毒核酶结构(HdvRz)。将带有分子标签和核酶结构的IBDV基因组插入载体pCAGGS的β肌动蛋白启动子下游,构建IBDV感染性克隆pCAGGmGtAHRT和pCAGGmGtBHRT,LipofectamineTM2000介导共转染DFI细胞,进行病毒拯救研究。【结果】构建的IBDV感染性克隆可在DFI、Vero/E6、Vero/P1...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王小敏 何孔旺 张文文 周忠涛 茅爱华 俞正玉 温立斌 倪艳秀 张雪寒 郭容利 吕立新 李彬 周俊明
研究2009-2010年我国部分地区猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)混合感染的情况。采用PCR和RT-PCR方法对采集自我国安徽、江苏、山东、浙江等7省的227份组织和血清样品进行PCV2和PRRSV检测。PCV2a感染率为15.9%,PCV2b感染率为44.5%,PRRSV感染率为45.8%,其中17份样品表现为PCV2a和PRRSV的混合感染,50份样品表现为PCV2b和PRRSV的混合感染,10份样品表现为PCV2a,PCV2b和PRRSV的混合感染,分别占样品总数的7.5%,22.0%和4.4%。猪群中PCV2和PRRSV的感染比较普遍,混合感染率也较高...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王新 郭万柱 周婷 徐志文 王印 王小玉
【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因疫苗,并对其免疫效果和安全性进行研究。【方法】将PCV2ORF2基因从pMD-ORF2*质粒(包含PCV2 SCH A株ORF2基因)酶切回收,插入到真核表达载体pcD-NA-3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA-ORF2,对该质粒进行酶切和PCR鉴定。将pcDNA-ORF2转染IBRS-2细胞,进行Western blotting检测。将构建好的pcDNA-ORF2制成核酸疫苗,按100μg/只腿部肌肉注射免疫Balb/c小白鼠,同时设pcDNA-3.1(+),PCV2全毒和PBS为对照,共免疫2次,间隔2周。分别于首免后第14天和56...
关键词：
猪圆环病毒2型 ORF2基因 核酸疫苗
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨增岐 祝卫国 王旭荣 张涌
应用PCR扩增得到猪2型圆环病毒ORF2基因的3′端约600 bp,该PCV2 ORF2基因已去除终止子,并分别在其上下游添加Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点。PCR产物用Kpn Ⅰ和 Hind Ⅲ酶切后,与经同样处理过的 pBAD/g Ⅲ B Vector连接,转化TOP10细胞后挑取阳性克隆,经酶切鉴定和测序验证后用L-arabinose诱导进行融合表达,表达的蛋白主要以包涵体存在。经过镍离子亲和层析柱纯化,SDS-PAGE显示1条约28 ku的目的条带, 纯度达到85％以上。以该28 ku的多肽包被酶标板,建立了PCV2的间接ELISA检测方法。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨增岐 田小艳 张涌 祝卫国 王旭荣 谢俊良 杨永宁 张锦俊
根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的序列,设计2对PCR引物,对疑似PCV2感染猪的血液、肺脏和淋巴结等病料进行套式PCR扩增检测,并对PCR检测为PCV2阳性的病料进行PCV2分离与鉴定。结果显示,PCV2在PK-15细胞上生长良好,但增殖较慢且不产生细胞病变;在第12代细胞培养物中用间接免疫荧光试验(IFA)和PCR扩增反应均能检测到PCV2,且特异性很强。表明试验分离的病毒为PCV2。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
修金生 吴顺意 曾新斌 陈小权
参考GenBank上的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因序列,根据其开放阅读框ORF1保守序列设计引物,建立基于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法来检测PCV2.所建立的荧光定量PCR方法最低检测限为82.2拷贝.反应-1,与常规PCR相比,灵敏度高出100倍.扩增产物的融解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,溶解温度为(85.98±0.13)℃,对猪圆环病毒1型(PCV1)、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒无扩增,可重复性好,组内变异系数为0.29%-1.35%,组间变异系数为0.96%-2.42%,检测速度快,从样本处理到报告结果得出仅需3 h....
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