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[期刊] 西南农业学报
[作者]
汪伟 王小敏 何孔旺 温立斌 倪艳秀
通过ＰＣＶ２病毒感染３Ｄ４／２１猪肺泡巨噬细胞后炎症相关细胞因子ｍＲＮＡ转录水平变化，探讨ＰＣＶ２感染后可能的致病途径。通过ＰＣＶ２病毒体外接种３Ｄ４／２１细胞，感染不同时间后，收集样品，采用荧光定量ＰＣＲ方法检测细胞因子ＩＬ－１β、ＩＬ－８及ＩＬ－１８ｍＲＮＡ转录水平的变化。结果显示ＰＣＶ２对３Ｄ４／２１细胞的ＩＬ－１β、ＩＬ－８转录主要起抑制作用，对ＩＬ－８转录起促进作用。推测其在体内的综合效应导致感染早期机体抗病毒能力降低，引起机体免疫抑制，影响机体特异性免疫应答的正常运转，为ＰＣＶＤ的发病创造了条件。
[期刊] 华北农学报
[作者]
温立斌 何孔旺 杨汉春 刘梦雅
采用实时定量PCR技术对类猪圆环病毒因子P1感染猪不同时相猪肺泡巨噬细胞中外源性抗原加工递呈相关分子SLA-DR、SLA-DM和CD74及共刺激分子CD40、CD80和CD86 mRNA的表达进行了检测。结果表明,病毒感染后3 d,上述分子的mRNA表达皆低于对照组相应分子的mRNA表达。其中,CD80 mRNA的表达呈下调趋势(P<0.1),CD40、CD74和SLA-DR的mRNA的表达显著下调(P<0.1);...
[期刊] 华北农学报
[作者]
盛金良 陈创夫 杨霞 王远志 张辉
为确定toll样受体家族在绵羊肺泡巨噬细胞的分布及脂多糖(LPS)刺激过程中TLR2、4的动态表达规律。通过RT-PCR方法检测绵羊TLR1-TLR10表达分布;以α-tubulin和GAPDH为内标基因,对绵羊TLR2、4进行克隆和测序,将重组质粒作为标准品建立实时定量PCR标准曲线,通过实时定量PCR方法检测LPS诱导0~48 hTLR2、4的动态表达。结果表明,在绵羊肺泡巨噬细胞中检测到TLR1、2、4、6、7、8、9、10的表达,而TLR3、5未见表达;α-tubulin和GAPDH在LPS诱导前后表达量存在显著差异,均不适合作为内标基因,以使用的细胞数和总RNA量进行均一化校正,发现...
[期刊] 华北农学报
[作者]
温立斌 何孔旺 杨汉春 郭容利 钟书霖 俞正玉 茅爱华
采用实时定量反转录多聚酶链反应方法,检测健康对照组及类圆环病毒因子P1感染组的猪外周血单个核细胞中TLRs mRNA的表达。结果表明,病毒感染后3 d,除TLR2和TLR10外,其余TLRs mRNA表达皆下调。此后不同时相感染组的TLRs mRNA表达水平基本都处于恢复、上调地位。具有明显变化的表现为感染后第24天和第40天,TLR2 mRNA的表达显著上调(P<0.1)。结果提示,TLR2和TLR9介导的炎性反应可能在P1识别及其致病机制中起重要作用。
[期刊] 华北农学报
[作者]
温立斌 何孔旺 杨汉春 郭容利 俞正玉 茅爱华 倪艳秀 张雪寒 周俊明 吕立新 李彬 王小敏
为探讨类猪圆环病毒2型因子P1感染对猪抗病毒蛋白分子mRNA转录的影响,将P1分子克隆接种30日龄健康广西巴马小型猪,利用实时荧光定量PCR技术对猪外周血单个核细胞抗病毒蛋白分子PKR、2'-5'OAS2、 RNase L和Mx1的mRNA转录水平的变化进行了定量分析。结果表明,PKR mRNA转录在接种后8 d和40 d呈上调趋势;而2'-5'OAS2 mRNA在3 d和17 d下调,Mx1 mRNA也在接种后17 d下调;RNaseL mRNA转录水平则没有发生明显变化。研究揭示P1感染猪后,机体的抗病毒蛋白的功能受到了不同程度的影响。
关键词：
P1 外周血单个核细胞 抗病毒蛋白
[期刊] 华北农学报
[作者]
温立斌 何孔旺 杨汉春 王玉然
旨为预测类猪圆环病毒因子P1 VP2蛋白的B细胞表位。采用生物信息软件和互联网服务器,预测VP2的二级结构,分析VP2表面特性(亲水性、可塑性、可及性和抗原性),综合预测VP2的B细胞抗原表位。结果表明,P1VP2蛋白肽链的6-18和80-92区段为预测的B细胞表位优势区。多参数方案综合预测P1 VP2蛋白的B细胞抗原表位,为进一步鉴定表位及设计疫苗奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
温立斌 何孔旺 杨汉春 王玉然 董美响
研究类猪圆环病毒2型因子P1体内诱导的细胞凋亡作用。将P1分子克隆接种普通仔猪,用原位末端标记技术(TUNEL)检测猪的扁桃体、脾脏、腹股沟淋巴结等免疫器官细胞的凋亡情况。猪感染P1后21和35 d的扁桃体、脾脏和腹股沟淋巴结等免疫器官细胞出现了凋亡。P1可能引起猪的免疫抑制。
关键词：
猪圆环病毒2型 P1 凋亡 TUNEL
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张新晨 赵其岭 陈萌萌 孙嘉瑞 鲍恩东 张书霞 吕英军
【目的】研究猪圆环病毒２型（ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ２，ｐｃｖ２）感染ｐＫ－１５细胞后调控β－干扰素（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－β，ｉｆｎ－β）生成的信号通路，为猪圆环病毒病的发生机理和防治提供理论基础。【方法】将ｐＫ－１５细胞随机分成５组：对照组、ｐｃｖ２组、ＢＸ７９５（ｔＢＫ１／ｉＫＫε抑制剂）组、ＢＡｙ １１－７０８２（ｎｆ－κＢ抑制剂）组和ＢＸ７９５＋ＢＡｙ１１－７０８２（混合抑制剂）组。ＢＸ７９５组、ＢＡｙ １１－７０８２组、ＢＸ７９５＋ＢＡｙ １１－７０８２组分别用０．５μｍｏｌ ＢＸ７９５、５μｍｏｌ ＢＡｙ１１－７０８２、０．５μｍｏｌ ＢＸ７９５＋５μｍｏｌ．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
肖红 何珍 田棋 黄鑫淼 廖卫东 黄廷华 姚敏
利用增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表征鼠伤寒沙门氏菌株14028(Sal-14028),以研究其在猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)中的示踪作用，首先将增强型绿色荧光蛋白基因通过电击法转入Sal-14028,经卡那霉素抗性培养基筛选和测序鉴定，获得了具有绿色荧光信号的阳性菌株并检测其荧光稳定性，命名为Sal-pPpagC-EGFP。接着在同等条件下对比荧光菌株和野生菌株(WT)的生长特性，通过小鼠感染试验检测EGFP基因的插入对荧光菌株毒力有无明显影响，以分析荧光菌株的生物学特性；应用荧光显微镜和间接免疫荧光法检测荧光菌株在猪肺泡巨噬细胞3D4/21吞噬溶酶体中的定位情况。结果显示，在不同时间点，EGFP标记的鼠伤寒沙门氏菌在荧光显微镜下发出强烈的绿色荧光，且所带荧光不受抗性选择的影响，可稳定遗传。相同培养条件下，荧光菌株Sal-pPpagC-EGFP生长曲线的变化趋势与野生株基本相同。另外，经过改良寇氏法计算出的LD_(50)与野生株相比无显著差异(P>0.05),说明EGFP基因的插入对荧光菌株毒力无明显影响。荧光菌株在感染猪肺泡巨噬细胞后，吞噬溶酶体内可观察到标记菌株，并随着时间增加菌株数量呈现增长趋势。表明荧光菌株除了具备发光特性外，其他生物学性状没有明显改变。
[期刊] 华北农学报
[作者]
温立斌 何孔旺 杨汉春 王玉然 李广东 惠孝鑫
为了研究类猪圆环病毒2型因子P1和P2体外诱导的细胞凋亡作用,将P1和P2分子克隆分别转染PK-15细胞。结果表明,用透射电镜可以观察到P1和P2诱导PK-15细胞出现凋亡的典型形态学变化。
[期刊] 华北农学报
[作者]
温立斌 王凤芝 何孔旺 解建平 贾化生
旨在探讨类猪圆环病毒P1感染对PK15细胞自噬的影响。将同一批PK15细胞分成对照组和感染组,感染组在类猪圆环病毒P1感染PK15细胞后14,24,48 h分别收集细胞,对照组也在同样时间收获,用透射电镜观察自噬现象的发生。结果表明,与对照组相比,感染组PK15细胞内出现典型自噬形态学变化。揭示类猪圆环病毒P1能诱导PK15细胞发生自噬,但细胞发生自噬的相关信号传导通路还有待进一步研究。
关键词：
类猪圆环病毒P1 PK15细胞 自噬
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王攀 陶晓莉 沈祖楠 李和刚 潘杰 牟玉莲 李奎
【目的】探讨五指山小型猪近交系主动脉内皮细胞体外分离培养和鉴定的方法,研究LPS对内皮细胞TLR2表达的影响及TLR2介导内皮细胞炎症因子的表达情况。【方法】以3—4月龄的五指山小型猪近交系为试验材料,取其胸腹主动脉,采用0.1%I型胶原酶消化分离主动脉内皮细胞。利用细胞吸收DiI-Ac-LDL试验和流式细胞仪检测CD31的特异表达两种方法进行内皮细胞的鉴定。1μg.mL-1LPS刺激内皮细胞0、6、8和12 h,实时荧光定量PCR检测TLR2和TLR4的表达量;1μg.mL-1LPS刺激内皮细胞12 h后,10μg.mL-1LTA孵育0、6和12 h,实时荧光定量PCR检测炎症因子IL-6、...
[期刊] 水产学报
[作者]
龙建杰 朱新平 史燕 赵建 洪孝友
巨噬细胞炎症蛋白-3α是一种可诱导的分泌蛋白,通过相应受体对多种免疫细胞产生趋化,在多种疾病的免疫反应和炎症损伤中发挥重要作用。实验采用RT-PCR技术克隆出黄喉拟水龟巨噬细胞炎症蛋白-3α(MaCCL20)的成熟肽基因序列,通过双酶切将目的基因序列插入到表达载体pET-32a上,然后转化进大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后表达出了pET-32a-CCL20融合蛋白,以该融合蛋白为抗原制备多克隆抗体并进行Western-blotting鉴定及抑菌性检测。实验表明,融合蛋白在37℃、0.8 mmol/L IPTG,4 h条件下得到高效表达;经SDS-PAGE凝胶电泳和Western-blott...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王印 李昕然 姜雪梅 徐志文
从GenBank发表的PCV-2全基因组序列,随机选择其中的32个全基因序列,做序列比对和同源性比较,绘制系统进化树,在注释中找到ORF1编码的rep蛋白氨基酸序列,用在线生物信息学工具对其进行亚细胞定位分析。结果基本符合"来自同一地区的基因序列同源性较高"的规律,表明了PCV的高度保守性,亚细胞定位分析发现其rep蛋白定位于核区的指数为0.76,这与病毒在宿主细胞核内复制分不开。结果同时表明其定位于过氧化物酶体的指数显著不同于其他(过氧化物酶体平均0.36,可变,溶酶体、线粒体均为0.1不变)这可能与pcv的组织嗜性以及复制靶细胞(多为单核/巨噬细胞)的原因相关。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王凤芝 温立斌 何孔旺 姚火春 王小敏
为了鉴定类猪圆环病毒P1 VP1蛋白能否在体外自组装成病毒样颗粒(VLPs),首先PCR扩增P1 ORF1基因,利用p Fast BacTM1载体构建重组质粒,通过脂质体转染在Sf9细胞中表达P1 ORF1基因。然后通过RT-PCR技术及Western Blot分别从转录和蛋白质水平上鉴定该基因的表达,应用透射电镜观察该蛋白质是否形成了VLPs。结果显示,转染Sf9细胞后,第5天开始出现细胞病变;从接毒细胞中提取总RNA,经Recombinant DNaseⅠ处理除去基因组DNA后,RT-PCR能够扩增出362 bp的目的片段;收获接毒后72 h的细胞,Western Blot分析显示,P1 ...
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