为建立同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)4种病毒的多重PCR,分别针对PRRSV、SIV、PCV2和PRV保守序列设计4对特异性引物,建立同时检测这4种病毒的多重PCR,并对采自呼吸障碍病猪的病料进行检测。结果显示,PRRSV、SIV、PCV2、PRV扩增产物分别是275,650,482...

为建立能够同时检测7种导致猪呼吸道综合症疾病病原的多重PCR方法,参考伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、副猪嗜血杆菌(HPS)、多杀性巴氏杆菌(PM)以及胸膜肺炎放线杆菌(APP)标准毒株序列,选择各病毒和细菌的保守序列分别设计7对特异性引物进行多重PCR。各项优化试验结果表明,当反应的退火温度为51℃,各条引物浓度均为0.8μmol/L时扩增的目的条带效果最佳;用敏感性试验检测该反应中各病毒的最小检出量分别为:1.01×102(

根据猪瘟病毒(CSFV)的E2基因保守序列、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因及部分ORF6和3-UTR基因序列和猪乙型脑炎病毒(JEV)的E基因保守序列,设计了3对引物,扩增大小分别为288 bp4、30 bp和1 015 bp目的片段。以纯培养病毒抽提RNA,制备cDNA模板,利用3对引物,通过条件的优化,建立了同时检测这3种病毒的多重RT-PCR。CSFV、PRRSV和JEV的RNA最小检出量分别为0.270 ng、0.049 ng、0.067 ng,其它的RNA病毒如TGEV以及DNA病毒如PPV、PrV、PCV-2检测结果为阴性。以-βactin为对照,利用本方法...

为了提高牛呼吸疾病综合征多病原混合感染的临床诊断效率，以牛支原体（Mycoplasma bovis,M.b）oppD/F基因、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,P.m）ompH基因、溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica,M.h）gcp基因、牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV）gB基因、牛呼吸道合胞体病毒（bovine respiratory syncytial virus,BRSV）以及牛副流感病毒（bovine parainfluenza virus type,BPIV） 3型a和c基因型（BPIV-3a,-3c）的N基因等为检测靶标，分别设计特异性引物和Taqman探针，通过优化反应条件，采用3管7联的组合方式建立了7种病原体的多联实时荧光定量PCR检测方法。结果显示，该方法仅对本试验的7种病原有特异性反应，与其他常见病原无交叉反应。对M.b、P.m、M.h、IBRV、BRSV、BPIV-3a和BPIV-3c质粒标准品的最低检测限分别为10~2、10~2、10~1、10~2、10~2、10~2和10~1拷贝/μL。组内变异系数小于2.5%，组间变异系数小于5.5%。平行应用该方法和常规PCR方法对临床采集的115份有呼吸道症状牛的鼻拭子进行检测，P.m阳性率36.65%,M.b阳性率27.83%,M.h阳性率25.22%,IBRV阳性率11.30%,BPIV-3c阳性率8.57%,BRSV阳性率0.95%；其中混合感染率为26.1%。共检测到11种混合感染模式，主要由M.b与其他病原体的混合感染，占72.7%(8/11);M.b/P.m混合感染的检出率最高，占60%(18/30);M.b、P.m、M.h在混合感染中出现率排前三，其占比分别为73.3%(22/30)、73.3%(22/30)和43.3%(13/30)；其次为IBRV，占26.7%(8/30); BPIV-3c占13.3%(4/30)。以上结果表明，该方法具有较高的分析敏感性和特异性，可用于牛呼吸疾病综合征多病原感染的联合检测。

通过设计2对引物,建立了PRRSV的套式PCR方法,PRRSV细胞毒稀释10 000倍,依然能扩增出相应的片断,多次重复能得到一致的结果,非PRRSV病毒(猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒)均未扩增出相应片断。应用该方法对各地样品进行检测,表明建立的套式PCR方法适合进行流行病学调查。

牛呼吸疾病综合征是危害国内外养牛业的一种重要传染病，致病因素包括病毒、细菌以及支原体等病原体和多种应激。养殖一线人员常常只能通过观察牛的呼吸异常而做出初步诊断，对病原体诊断的准确率低。而且，由于该病具有多病因混合感染的特征，实验室诊断也常常针对性不强，导致难以对患病动物的治疗效果及预后做出精准判断。为了给牛呼吸疾病综合征的早期诊断、及时治疗和综合防控提供参考依据，本文就牛呼吸疾病综合征的病原学、流行和危害以及诊断方法进行综述，包括常见病原，临床诊断、分子生物学诊断等常用诊断方法，以及含有急性期蛋白和应激相关激素的宿主生物标志物诊断、转录组学诊断等新型诊断方法，简述其实际应用情况和优缺点，并对未来诊断方法的方向及待解决问题等提出展望。

“严重急性呼吸道综合征”(SARS)由于危害严重,引起人们的高度重视,在各国科研人员努力下,目前已完成了十几个毒株的分离与全基因组测序工作。本研究对世界各地分离的SARS毒株的基因组全序列进行比较,发现不同毒株的同源性在99.8％以上,SARS病毒的遗传稳定性较高;将SARS病毒与其它冠状病毒基因组以及编码蛋白质序列进行比较分析,证实SARS病毒是一种新的冠状病毒,可能进化起源较早,并发现SARS病毒和牛冠状病毒同源程度最高。SARS病毒orflab、orfla、S、M、N编码区氨基酸序列和牛冠状病毒同源程度最高,鼠肝炎病毒次之。

为了快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)nsp2基因缺失流行株,在对不同PRRSV分离株nsp2基因核苷酸序列分析的基础上,设计了针对nsp2基因的1对兼并PCR引物和1条基因特异性反转录引物。RT-PCR试验结果表明,经典PRRSVS1毒株和高致病性nsp2缺失株SY0608毒株的PCR扩增片段的大小分别为768 bp和678 bp。特异性试验和敏感性试验证明,该检测方法特异性较好,但敏感性相对较低,可用于快速鉴别诊断PRRSVnsp2基因缺失毒株和经典PRRSV毒株。

【目的】研究从江西、湖南发生持续高热的病猪体内分离的4株NSP2基因缺失的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Jiangxi-3、Jiangxi-4、Hunan-1、Hunan-2的致病力。【方法】通过Reed-Muench法,测定4株PRRSV(第3代)的TCID50,将毒株分别接种PRRSV和猪圆环病毒2型(PCV2)抗原与抗体均为阴性的健康猪,各设同居试验猪,通过检测体温、临床症状观察、RT-PCR、ELISA、病理切片等方法检测病毒的致病性。【结果】4株病毒的TCID50为10-3....

【目的】确定新疆南疆猪养殖场是否存在PRRSV感染,以及感染的PRRSV毒株类型及基因特点,从而针对性的有效防制PRRS。【方法】设计7对引物,对疑似PRRS发病猪场组织样品进行RT-PCR、克隆、测序和序列分析。【结果】47例样品,35例PRRSV阳性,阳性率高达74.47%(35/47);35株均为美洲型毒株,其中有10株属于高致病性PRRSV,占总检测样品的21.28%(10/47),占阳性样品的28.57%(10/35);综合分析本研究采集样品猪养殖场不存在欧洲型毒株。【结论】新疆南疆存在美洲型PRRSV感染,且存在高致病性毒株。

中国某地区猪繁殖和呼吸综合征流行病学调查及病毒分离姜平简中友马志勇蔡宝祥张振兴（南京农业大学畜禽传染病研究室，南京２１００９５）ＥＰＩＺＯＯＴＩＯＬＯＧＹＡＮＤＶＩＲＵＳＩＳＯＬＡＴＩＯＮＯＦＰＯＲＣＩＮＥＲＥＰＲＯＤＵＣＴＩＶＥＡＮＤＲＥＳＰＩＲ...

旨为建立高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)野毒株持续性感染细胞模型。通过将HP-PRRSV野毒株JX143感染Marc-145细胞,感染的细胞经连续传代35代,建立了稳定的PRRSV持续感染的细胞模型,获得了JX143-Marc-145-P35细胞株。应用RT-PCR、免疫荧光、空斑形态分析等技术跟踪观察了JX143-Marc145细胞株连续传代过程中病毒在细胞内的存在和生物学特性的变化。为了进一步分析病毒持续性感染过程中基因的特征性变化,通过RT-PCR扩增出JX143-Marc145-P35的全基因,并进行测序和序列分析。结果表明,在细胞模型建立的过程中,细胞病变(Cyto...

在对国内某地区７个患病猪群流行病学调查的基础上，用Ｍａｒｃ１４５细胞培养从４个猪群流产胎儿分离到３株导致细胞病变的病毒———Ｊ１、Ｊ２和Ｊ３株。它们对氯仿和热（５６℃，１ｈ）、甲醛、酸、碱均敏感。病毒粒子呈球状，直径３０～８０ｎｍ，负染后病毒粒子大小８０～１００ｎｍ，在Ｍａｒｃ１４５细胞质内增殖，５溴２′脱氧尿核苷（ＢＵＤＲ）对其无抑制作用。结合血清学试验，鉴定３个毒株均为猪繁殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ），可能为美洲型ＰＲＲＳＶ。

为了得到一种能够高通量检测细胞培养物的方法,并将其用于筛选特异性强、敏感度高的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)单克隆抗体。用每孔能感染约100个细胞的病毒量接种单层覆盖96孔板的Marc-145细胞,12 h后用含3%H_2O_2的甲醇固定细胞,以制备免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)反应板。以100μL/孔的量将融合后继续培养10 d的杂交瘤细胞的培养上清加入至IPMA反应板,以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG-HRP作为二抗,以3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)作为显色底物,于倒置显微镜下进行观察。结果表明,共筛选出1D1、7G8等39份PRRSV单克隆抗体,这39份单抗能够使PRRSV中高致病毒株HN07-1和经典毒株BJ-4感染的Marc-145细胞被特异性染色,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒感染的Marc-145细胞无交叉染色。因此,构建的IPMA方法能够敏感、准确地捕捉到PRRSV单克隆抗体。

【目的】以纯化的牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)HJ株重组N蛋白作为包被抗原,对各项条件进行优化,确定判定标准,建立检测BRSV抗体的间接ELISA方法。【方法】将已构建的重组菌BL21(DE3)进行诱导表达,获得重组N蛋白。利用电洗脱法对表达产物进行纯化,并用Western blot对表达产物进行鉴定。以纯化后的重组N蛋白作为诊断抗原,对ELISA反应条件进行优化,初步建立检测BRSV抗体的间接ELISA诊断方法。【结果】成功表达并纯化了BRSV HJ株重组N蛋白,Western blot检测结果证明表达产物具有良好的反应原性。以重组N蛋白作为诊断抗原,建立了间接ELISA诊断方法。交叉试验结...