与牛羊等动物的体外胚胎生产(invitroproduction,IVP)技术相比,猪IVP技术尚不成熟。猪IVP主要存在卵母细胞的细胞质成熟差、多精子受精率高和胚胎质量差的问题,这严重制约了该繁殖生物技术在转基因猪生物反应器领域的应用。笔者在查阅近10年的国内、外相关研究后,从如何优化猪卵母细胞的体外成熟(invitromaturation,IVM)、体外受精(invitrofertilization,IVF)和胚胎的体外培养(invitroculture,IVC)3个方面进行了探讨。

为了将绵羊体外胚胎发育技术应用于生产，采用活体采卵－体外受精的方法，对准备淘汰的杜泊羊进行外源激素处理，并对可能影响体外胚胎发育及移植后受胎效率如ＦＳＨ剂量、公羊个体、获取卵母细胞方式等因素进行研究，结果发现：（１）每只供体注射ＦＳＨ ２４０ＩＵ或４２０ＩＵ剂量对获得卵母细胞数、胚胎数及体外受精卵裂率没有明显影响（Ｐ＞０．０５）；（２）不同公羊个体对卵母细胞体外受精效率有显著影响，但胚胎移植后受胎率没有明显影响（Ｐ＞０．０５）；（３）活体采卵与屠宰场采卵方式相比，对卵母细胞的回收没有影响（１２．２４ｖＳ １３．８４，Ｐ＞０．０５），但活体采集卵母细胞受精后的平均胚胎数显著低于后者（７．５０ｖＳ．．．

【目的】探讨猪类胚胎生殖细胞向神经细胞分化的潜能。【方法】采用性腺-中肾区基质细胞与猪原始生殖细胞共培养的方法得到猪类胚胎生殖细胞,通过直接分化的方法进行神经细胞定向诱导。【结果】(1)与小鼠成纤维细胞作为饲养层相比,性腺-中肾区基质细胞作为饲养层同样能够支持猪类胚胎生殖细胞生长,二者对猪类胚胎生殖细胞的增殖能力不存在显著影响;(2)猪类胚胎生殖细胞有较强的碱性磷酸酶活性,Q-PCR结果显示多能性基因Oct4、Sox2及Nanog表达,增殖能力呈现"S"型,即生长的潜伏期、对数期及平台期,猪类胚胎生殖细胞经体外悬浮培养能够形成拟胚体;(3)经过诱导猪类胚胎生殖细胞能够分化形成表达神经干细胞、神...

胚胎干细胞是由早期内细胞团分离的一种多潜能细胞 ,在体外分化抑制培养时 ,可保持未分化状态而无限增殖。一旦撤除分化抑制因素 ,或添加适当的诱导剂 ,ES细胞可分化为内胚层、中胚层和外胚层的多种类型的特化细胞。文章综述了体外定向诱导 ES细胞分化为造血细胞、心肌细胞、神经细胞、脂肪细胞、胰岛细胞、内皮细胞、上皮细胞、成骨细胞、软骨细胞和黑素细胞等的途径和方法。

【目的】比较绵羊卵母细胞体外受精后卵裂快慢对胚胎发育潜能及移植怀孕率的影响。【方法】使用因卵巢粘连无法作为超排供体的成年杜泊母羊，常规激素诱导卵泡超数发育，手术或屠宰回收卵丘-卵母细胞复合体（COCs），进行体外成熟（IVM），体外受精（IVF）和体外培养（IVC）。分别统计受精24，36，48 h卵裂情况及第7天的囊胚率，并按实验设计进行移植，统计怀孕率。其中，受精24 h 及之前卵裂的记为卵裂快组，受精24 h 之后卵裂的胚胎记为卵裂慢组。【结果】①卵裂快组胚胎占总胚胎数比例达77.85%，极显著高于卵裂慢组的22.15%（P < 0.01）；②卵裂快组囊胚率极显著高于卵裂慢组（68.95% vs 26.91%，P < 0.01）；③卵裂快组的早期胚胎移植单枚或双枚，怀孕率差异不显著（64.05% vs 65.62%，P > 0.05）；④卵裂慢组的早期胚胎移植两枚的怀孕率极显著高于移植单枚的结果（33.89% vs 11.67%，P< 0.01），但均极显著低于卵裂快组的胚胎（P< 0.01）；⑤囊胚单、双胚移植怀孕率无显著差异（69.33%vs 70.46%，P > 0.05）；⑥受精后24 h或48 h移植，对怀孕率没有影响；⑦从形态上无法判断早期胚胎的质量。【结论】绵羊体外早期胚胎，卵裂快组单枚移植，卵裂慢组双枚移植，囊胚单枚移植，能提高胚胎利用率。

目的本研究系统比较了体外受精胚(IVFEs)、孤雌激活胚(PAEs)以及体细胞核移植胚(NTEs)的发育率和囊胚质量,同时还比较了PZM-3和NCSU-23两种培养基培养对PAEs以及NTEs发育的影响。方法利用体细胞核移植技术、体外受精技术和孤雌激活技术分别生产猪的NTEs、IVFEs和PAEs,开展体外培养。结果(1)IVFEs、PAEs和NTEs的卵裂率分别为72.0%,66.0%和63.5%,各组间没有显著差异(P>0.05);囊胚形成率分别为11.0%,22.6%和16.9%,也不存在明显不同(P>0.05);然而,在囊胚质量,即ICM细胞数/总细胞数的比例上,IVFEs和NTEs均...

【目的】通过优化猪体细胞核移植程序,建立获得克隆囊胚的有效方法。【方法】比较不同电激活参数、不同体外培养条件对猪体细胞克隆胚发育能力的影响。【结果】选用1.5kV·cm-1、80μs和1DC的参数组合,对猪核移植重构胚进行电融合和电激活,可获得较高的卵裂率和最高的囊胚发育率(分别为71.4%和14.3%),且囊胚发育率显著高于其它组(P<0.05);0.4%BSANCSU23培养液培养克隆重构胚72h,半量换液并未改善克隆胚的发育,但添加10%FBS可显著提高囊胚发育率(15.1%对10.3%,P<0.05)和DNA完整率(56.8%对46.6%,P<0.05);采用猪卵泡颗粒细胞(pGC)共...

研究了牛体外受精后早期胚胎体外发育时,向其基础培养液中加入牛磺酸对胚胎桑椹胚率、囊胚率和孵化囊胚率的影响,以探寻牛磺酸克服牛胚胎"体外发育阻滞"现象的作用。试验结果表明:以TCM-199+10%FBS为基础培养液(对照组),再加入7,14mM的牛磺酸(试验组),试验组与对照组的桑椹胚率分别为48.1%、47.4%和43.2%;囊胚率分别为26.4%、22.3%和21.0%;孵化囊胚率分别为21.8%、18.7%和0%。IVF后2细胞、4～8细胞及8～16细胞期,在基础培养液中分别添加7mM的牛磺酸时,桑椹胚率分别为48.7%、57.1%和52.0%,囊胚率分别为25.1%、30.7%和27.9...

:研究中华鳖胚胎细胞体外培养适宜培养渗透压、培养基和培养温度等条件 ,并进行传代试验。结果表明 ,胚胎原代细胞在 2 5～ 2 8℃ ,渗透压 2 50mmol/kg ,RPMI - 16 4 0 +10 %小牛血清培养液及无CO2 的条件下 ,生长良好 ,72h长满单层 ,并能顺利传代。细胞动力学试验表明 :传代细胞 1～ 3代为适应期、4～ 6代为旺盛期、7～ 9代为衰退期。第 6代细胞染色体组型分析 ,其染色体为整二倍体 ,并未发生转化

分别利用孤雌激活技术、体外受精技术及体细胞核移植技术生产不同类型的体外胚胎,比较不同类型胚胎的体外发育率和囊胚细胞总数间的差异,研究季节、卵巢保存条件和培养液对孤雌激活胚(PAE)和体细胞核移植胚(SCNTE)发育能力的影响。结果表明:PAE、SCNTE和体外受精胚(IVFE)的卵裂率没有显著差异;PAE的囊胚率(23.4%)显著高于SCNTE(18.2%);SCNTE的囊胚细胞数(120)显著多于PAE的囊胚细胞数(96),而与IVFE的囊胚细胞数(107)没有显著差异。繁殖季节卵巢PAE和SCNTE的发育率显著高于非繁殖季节。卵巢在14~18℃保存15~17 h,没有影响PAE的体外发育,...

　在TCM-199中添加一些确定的辅助成分,探讨在无血清培养基中添加不同浓度HA对牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎体外发育的影响。结果表明,在卵母细胞成熟培养液(TCM-199-m)中添加4.0mg/mL的HA时,卵母细胞的成熟率和卵裂率与对照组(BSA)无显著差异(P>0.05),分别为85.14%,83.57%和89.47%,85.24%,但显著高于其他各浓度组(P0.05),分别为27.64%和26.51%,但显著高于TCM-199-...

研究了不同生殖时期猪输卵管上皮细胞对小鼠早期胚胎体外发育的影响,以此建立了适于早期小鼠转基因胚胎体外培养的猪输卵管上皮细胞共培养体系,并用PCR法对体外培养发育到不同阶段的小鼠转基因胚胎进行了外源基因整合检测。结果表明,在受孕初期的猪输卵管上皮细胞(无论是原代还是传代细胞)上,培养的小鼠1-细胞期胚胎的囊胚率显著高于发情间期的猪输卵管上皮细胞(P<0.01);在相同生殖时期猪输卵管原代和传代上皮细胞上,培养的小鼠1-细胞期胚胎的囊胚率差异不显著;在转基因胚胎不同发育阶段,PCR检测呈阳性的胚胎比率分别为:2-细胞期为96%,4-细胞期为63%,8-细胞期为43%,囊胚期为19%。由此可见,受孕...

【目的】探究亚硒酸钠（sodium selenite,SS）对猪卵母细胞体外成熟及其胚胎发育潜能的影响并对其机制进行初步分析，为猪卵母细胞体外成熟体系的完善提供理论参考。【方法】将猪卵丘卵母细胞复合物（cumulus oocyte complexes,COCs）随机放在不同浓度亚硒酸钠(0、20、40、60、80 nmol·L^-1)的成熟培养液中成熟培养44 h后，分别观察卵丘细胞扩展及卵母细胞第一极体（first polar body,PB1）排出情况，收集卵丘细胞并提取其RNA，同时对卵母细胞进行孤雌激活（parthenogenetic activation,PA）处理并进一步对孤雌胚胎进行体外培养，分别于48、168 h统计卵裂率及囊胚率。利用实时荧光定量PCR及观察法对卵丘细胞扩展指数（CEI）、卵丘扩展相关基因（Has2、Ptgs2）表达、卵母细胞第一极体（PB1）排出率和孤雌胚胎的卵裂率及囊胚率进行检测，以探究不同浓度亚硒酸钠对卵母细胞成熟、早期胚胎发育及卵丘细胞扩展的影响，并据此确定亚硒酸钠的最适添加浓度；通过光吸收法及RT-q PCR检测COCs的总抗氧化能力、卵母细胞中谷胱甘肽（GSH）含量和丙二醛（MDA）水平及抗氧化基因（CAT、PRDX2）表达，探讨体外成熟液中添加亚硒酸钠对卵母细胞抗氧化能力的影响；结合免疫荧光技术对囊胚内细胞总数和囊胚多能性基因（Nanog,Sox2）表达进行检测，探究亚硒酸钠对孤雌胚胎发育潜能的影响。【结果】QRT-PCR结果显示不同浓度亚硒酸钠添加均可显著促进PTGS2基因的表达（P<0.05），且40 nmol·L^-1浓度下HAS2基因的表达、CEI、卵母细胞PB1、早期胚胎的囊胚率都得到显著促进（P<0.05）;40、60、80、nmol·L^-1浓度下亚硒酸钠添加都可促进卵母细胞的卵裂，但40 nmol·L^-1浓度下卵裂促进效果显著（P<0.05），据此确定猪卵母细胞体外成熟液中亚硒酸钠添加浓度为40 nmol·L^-1；由抗氧化能力检测结果显示亚硒酸钠可显著提高COCs的总抗氧化能力、卵母细胞的GSH水平、抗氧化基因CAT、PRDX2的表达、显著降低MDA含量（P<0.05）；免疫荧光及PCR结果显示，亚硒酸钠组中囊胚的内细胞团数量升高、Nanog表达升高（P<0.05）。【结论】猪卵母细胞体外成熟液中添加适宜浓度的亚硒酸钠可促进卵丘细胞扩展，提高卵母细胞的成熟率，改善卵母细胞成熟后的发育潜能。亚硒酸钠对卵母细胞体外成熟的这一有利影响可能与其抗氧化作用有关。

为了探讨胰岛素和胚胎培养密度对猪孤雌胚早期体外发育的影响,进一步优化猪早期胚胎培养体系,分别进行了胚胎培养液(NCSU-23)中添加不同批号和浓度的胰岛素以及不同胚胎培养密度(培养滴体积)对猪孤雌胚早期胚胎体外发育的影响试验,并于第2、7天分别统计胚胎分裂率和囊胚发育率。结果表明:①在NCSU-23中添加5.0μg/mL批号为I-1882(Sigma公司)的胰岛素,其囊胚发育率最高,为(33.48±12.79)%;②在体外培养25枚猪孤雌胚时,按胚胎数(枚)l培养液体积(μl)为1∶2.0~1∶3.0的比例进行培养,其培养效果较好。

为进一步完善猪胚胎体外发育系统,以孤雌激活胚胎为研究对象,依次对胚胎培养液种类、培养期间血清添加方式、卵丘细胞共培养体系进行筛选优化。结果表明,与常规的PZM3培养液相比,CR1aa并不适合猪胚胎的体外发育;猪胚胎在PZM3中培养4d后添加10%胎牛血清培养至第6天,体外发育能力得到显著改善,卵裂率、囊胚率、囊胚孵化率、囊胚细胞数分别达到95.1%、56.5%、27.3%、79.3;在此基础上,利用山羊卵丘细胞与猪胚胎进行共培养,将囊胚孵化率进一步提高至36.6%,初步建立了一套高效稳定的猪胚胎体外发育系统。