以猪卵泡为试验材料,在总结各种分类方法的同时,通过具体的试验分析了几种可持续跟踪研究的分类方法(外观形态、颗粒细胞密度、孕酮(P4)和雌二醇(E2)的比值)间的关系。经过对239个卵泡的分离和检测,以及对在不同闭锁阶段各20个共60个在各个判定指标上都达到一致的卵泡进行分析和比较,检验各判定指标与猪卵泡闭锁的关系,形成了合理的综合判定标准:在外观判定基础上将颗粒细胞数小于2 500μL-1、2 500～10 000μL-1、大于10 000μL-1分别定义为健康、早期闭锁及晚期闭锁卵泡,而相应的P4/E2值分别为小于5、5～20及大于20。

[目的]本文旨在通过对猪卵泡颗粒细胞进行转录组测序了解卵泡闭锁相关基因的表达谱并确定闭锁卵泡的潜在分子标记物。[方法]通过HE染色对卵泡及颗粒细胞进行形态学观察；抽取健康卵泡和晚期闭锁卵泡的颗粒细胞，进行转录组测序分析，最后采用实时荧光定量PCR检测差异表达基因的相对表达水平。[结果]转录组数据表明，与闭锁卵泡颗粒细胞相比，健康卵泡颗粒细胞中有771个差异基因，其中204个为上调基因，567个为下调基因；GO功能富集分析显示，差异基因显著富集到320个生物进程中，主要与细胞增殖和血管生成有关；KEGG通路分析表明，差异基因富集到48条信号通路中，主要参与氧化应激、激素合成和能量代谢等方面的信号通路；实时荧光定量PCR结果表明，CYP1B1、PDE10A、NUPR1、NOX4、LDLR、LHCGR和CYP19A1表达趋势与测序结果一致。[结论]氧化应激、血管生成、能量代谢以及激素合成等多方面因素综合调控猪卵巢中颗粒细胞的凋亡，继而影响卵泡闭锁现象的产生。

【目的】通过分析成熟卵泡液外泌体(mature follicular fiuid Exosomes, mffEXs)和闭锁卵泡液外泌体(atretic follicular fiuid Exosomes, affEXs)miRNA的表达差异,探索卵泡液外泌体(EXs)miRNA在卵泡发育和闭锁过程中的调控作用。【方法】本研究通过抽提4—6 mm猪成熟发育和闭锁卵泡的卵泡液分离外泌体,进行粒径分析及Western Blot检测对EXs进行鉴定,接下来对特征性EXs携带的miRNA测序和功能富集分析,筛选关键信号通路和差异基因。最后,将mffEXs和affEXs作为添加剂进行颗粒细胞培养,利用Q-PCR检测技术分析关键基因的表达,验证两类卵泡液内EXs miRNA在卵泡发育中的调控功能。【结果】成功分离了mffEXs和affEXs,对比mffEXs测序结果,affEXs中有90个miRNA上调表达,220个miRNA下调表达,表明了卵泡液中的miRNA表达水平与调控卵泡发育有关;KEGG富集分析结果显示两类卵泡的差异信号通路主要集中在Ras、cAMP、P53和MAPK等信号通路,涉及调控卵母细胞发育、减数分裂以及颗粒细胞细胞周期等生物学功能。在闭锁卵泡中,上调表达的ssc-let-7a和ssc-miR-133a-3p分别潜在靶向调控细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK1)和胰岛素生长因子(IGF1),抑制了G1和G2/M期的运转和类固醇激素代谢,促使颗粒细胞周期运转受阻和颗粒细胞凋亡,引起卵泡闭锁的发生;下调的ssc-miR-21-5p潜在靶向肿瘤抑癌基因(P53),抑制细胞周期运转,促使颗粒细胞凋亡。在体外培养的颗粒细胞中分别添加mffEXs和affEXs,Q-PCR结果显示CDK1在mffEXs中显著上调表达,而P53显著下调表达,表明了测序分析结果的可靠性。这些结果均显示了affEXs中miRNA表达水平的变化促使颗粒细胞凋亡和细胞周期阻滞,引起卵泡闭锁。【结论】猪affEXs携带miRNA增加了对CDK1、IGF1和P53的表达调控,抑制颗粒细胞细胞周期运转和类固醇激素代谢等信号通路,引起颗粒细胞凋亡,导致卵泡闭锁。

【目的】研究猪有腔卵泡发育和闭锁中颗粒细胞凋亡与卵泡液类固醇激素的变化,为了解猪有腔卵泡发育与闭锁的调控机理提供参考。【方法】从猪卵巢分离完整有腔卵泡,按质量分为健康卵泡、早期闭锁卵泡和晚期闭锁卵泡3类;再按卵泡直径大小分为大卵泡组(>5 mm)、中卵泡组(3~5 mm)和小卵泡组(

氧化应激被认为是影响动物繁殖性能和造成人类不孕不育的重要因素,氧化应激诱导卵泡颗粒细胞凋亡,进而诱发卵泡闭锁是其影响动物繁殖性能的重要途径。近年来,针对氧化应激对有腔卵泡闭锁的影响研究取得了系列进展,主要包括:氧化应激对卵泡闭锁具有重要调控作用;叉头盒转录因子O1(FoxO1)是氧化应激诱发卵泡闭锁的关键性调控因子;卵泡液因子能够调控卵泡颗粒细胞氧化损伤的发生与程度。

为了揭示caspase-3等细胞凋亡相关基因及DNA甲基化水平在小鼠卵泡闭锁中的作用,小鼠经注射10 IU hCG后,在0、12、24、48、72和96 h解剖取出卵巢,用HE染色、DNA电泳、免疫组化、RT-PCR技术、甲基化酶切等试验方法,研究在卵泡发育及闭锁过程中caspase-3等凋亡相关基因的表达及DNA甲基化水平的变化。结果表明:bax、caspase-3的表达量在48 h以前持续减少,在48 h达到最低值,在72 h显著增多(P

为了解闭锁繁殖群体中藏猪的胴体和肉质性能在不同世代间的变化。对一个闭锁繁殖藏猪群内的第1世代和第4,5世代的藏猪进行屠宰并对胴体性能和肉质性能进行测定。通过主成分分析和聚类分析发现第1世代藏猪与第4,5世代藏猪的胴体性能没有明显差异。对3个世代的肉质性能测定发现,第1世代和4,5世代pH值和L值没有显著差异(P> 0. 05),而第1世代藏猪具有较好的熟肉率(P

为分析巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)在不同直径健康猪卵泡上的表达变化规律,将收集到的90个健康母猪卵巢,通过ELISA检测不同直径卵泡液中MIF质量浓度,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测颗粒细胞中MIF基因mRNA和蛋白的表达水平,采用免疫荧光检测MIF在颗粒细胞中的分布情况。结果显示:1)中等直径卵泡(3～4mm)液中MIF的质量浓度(54.17±7.86ng/mL)显著高于大卵泡(>6mm,32.29±1.47ng/mL)和小卵泡(1～2mm,38.89±0.98ng/mL)(P<0.05);2)中等直径卵泡颗粒细胞中MIF基因mRNA和蛋白质表达量也显著高于大卵泡和小卵泡的表达量(P<0.05);3)MIF也在不同直径卵泡颗粒细胞中的细胞核和细胞质表达,但多集中于细胞质中。综上,随着猪卵泡发育过程,MIF在中等直径卵泡中表达量最高。本研究为母猪卵泡发育和排卵提供新的线索。

　以TCM-199成熟培养猪卵巢表面直径2～3mm,3～5mm和5～8mm卵泡内的卵母细胞,比较了成熟培养液中添加以上各组卵泡液(pFF)对猪卵母细胞体外成熟(IVM)的影响,以成熟培养48h后排出第一极体为成熟标准对猪卵母细胞进行成熟鉴定。结果表明,2～3mm,5～8mm和3～5mm3组卵泡内卵母细胞的体外成熟(IVM)率依次升高,分别为12.7%,31.3%和46.0%,各组间差异显著(P<0.05);添加3～5mm卵泡液的卵母细胞体外成熟率(42.0%)也显著高于5～8mm组(11.0%)和2～3mm组(12.7%)(P<0.05)。试验同时观察记录了不同直径卵泡内卵母细胞的等级,结果发...

【目的】分析去乙酰化酶SIRT1基因在猪不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达规律,为进一步了解SIRT1基因在猪卵泡发育中的调控机制奠定基础。【方法】采集猪卵巢,分离卵泡颗粒细胞,根据直径将其分为≤1.5mm,>1.5~≤3.0mm,>3.0~≤5.0mm,>5.0mm 4个组,利用免疫组织化学方法分析SIRT1蛋白在不同发育阶段卵泡颗粒细胞中的表达定位,利用qRT-PCR和Western blotting方法分析SIRT1基因在不同直径卵泡颗粒细胞中mRNA和蛋白的表达量。【结果】SIRT1蛋白在不同发育卵泡颗粒细胞中均有表达,随着卵泡的发育,SIRT1蛋白表达量逐渐升高,其在原始卵泡中表达量最...

【目的】探讨在具有不同超数排卵效果的绵羊品种中,进行超排处理后其卵巢上促卵泡素受体(FSH receptor,FSHR)的分布情况,为进一步研究二者的相关性及据此改进超排效果奠定基础。【方法】根据超数排卵效果优劣依次选择3个中国地方品种的绵羊:小尾寒羊、白滩羊和乌珠穆沁羊。在常规超排最后一次注射FSH后的8、16和24 h分别各取3只绵羊的卵巢,并采用免疫组织化学法观察3种绵羊卵巢上FSHR的分布情况。【结果】FSHR主要分布于3个品种绵羊卵巢的颗粒细胞上;小尾寒羊最后一次注射FSH后8、16和24 h的各时期卵泡中FSHR的表达都显著高于另外两个品种绵羊(P<0.05),在早期卵泡和中期卵泡...

为确定不同基础培养液和培养方法对猪腔前卵泡体外培养的影响,试验采用了M199和NCSU23两种基础培养液及96孔培养板法、凹窝培养法和颗粒细胞铺层培养法对猪腔前卵泡进行体外培养。结果表明:培养在M199的腔前卵泡生长显著快于培养在NCSU23的腔前卵泡,培养在该2组的猪腔前卵泡前5 d的生长速度都极显著地高于后5 d的生长速度,而腔前卵泡的成腔率和存活率没有明显差异;培养在凹窝培养体系的腔前卵泡生长速度显著低于96孔培养板法,但凹窝培养体系可以显著地增加腔前卵泡的存活率。同时证明,颗粒细胞铺层培养法对腔前卵泡生长没有显著影响。

通过分离纯化卵泡抑制素受体,确定其受体类型,旨在为抑制素的作用机制研究奠定基础。采集30头长白猪垂体组织制备膜蛋白,用亲和层析法从该蛋白组分中分离、纯化出抑制素受体。SDS-PAGE结果发现该受体提取物中有6种蛋白,分子质量从14 ku到130 ku不等,表明抑制素受体可能不是特异性的单一受体,而是共受体。改良的ELISA结果证实,该受体提取物特异性活性为99 U/mg,能与抑制素结合,且与剂量呈正相关(R=0.993)。

卵形鲳鲹雌雄鱼不具备性别特异的外形特征,发展一种可以简便鉴定卵形鲳鲹性别的技术是产业发展的迫切需要。通过一龄商品规格鱼性腺解剖学观察,发现商品规格鱼性腺已出现形态学上的明显差异,根据其形态学差异,建立了一种卵形鲳鲹早期的性别判定方法。进一步对性腺切片进行HE染色观察,发现上述形态学判定方法判断性别准确率达100%。形态学判定为雌鱼的性腺为典型的卵巢组织结构,有大量卵母细胞分布,而形态学判定为雄鱼的性腺观察到精小囊和精小叶等精巢典型结构。研究建立并验证的基于性腺解剖形态的卵形鲳鲹早期性别判定简易方法,可为下一步卵形鲳鲹性别决定机制研究和基于分子标记的早期性别鉴定方法建立提供参考材料。

［目的］本试验旨在研究毛喉素（FSK）对体外培养的猪卵泡颗粒细胞分化的作用及其机制。［方法］体外分离培养猪原代卵泡颗粒细胞，预培养24 h。应用FSK（10 nmol·L~(-1)）处理细胞48 h，检测细胞形态、脂滴积聚、标记基因和周期相关基因表达；处理96 h检测孕酮（P_(4)）水平及类固醇合成相关蛋白的表达。［结果］与对照组相比，FSK改变了细胞形态，增大了细胞直径，并使细胞内脂滴含量增加（P < 0.01）；FSK降低了细胞的增殖活性和增殖细胞核抗原（PCNA）mRNA的表达水平（P < 0.01）；FSK降低了颗粒细胞标记基因促卵泡素受体（FSHR）mRNA的表达水平，提高了黄体细胞标记基因前列腺素受体（PTGFR）和促黄体素受体（LHCGR）mRNA的表达水平（P < 0.01）；FSK促进了P_(4)分泌，提高了类固醇合成相关蛋白StAR、P450scc和3β-HSD的表达水平（P < 0.01）；从细胞周期看，FSK降低了细胞周期素B1（CCNB1）、细胞周期素D1（CCND1）和细胞周期蛋白依赖性激酶1 (CDK1）、细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）基因的表达（P < 0.01），而使细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A/B（P21~(cip1)/P27~(kip1)）基因表达上调（P < 0.01），并将细胞周期阻滞在G0/G1期。［结论］FSK能够通过抑制细胞增殖、增强脂滴积聚和孕酮合成代谢、退出细胞周期来促进颗粒细胞向黄体细胞转化。