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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
苏凤艳 宗春苗 王卓聪 丁庆东 王全凯
为了构建犬瘟热病毒F基因真核表达载体,利用RT-PCR方法扩增出水貂源犬瘟热病毒分离株的F基因,将其克隆至pMD-18T载体上,用BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因亚克隆至pcD-NA3.1(+)中,获得真核重组质粒pcDNA3.1-CDVF。通过脂质体介导法将pcDNA3.1-CDVF转染至BHK-21细胞中,并利用间接免疫荧光试验和RT-PCR法检测pcDNA3.1-CDVF在BHK-21细胞中的表达情况。结果表明,真核重组表达质粒pcDNA3.1-CDVF构建成功,F基因可在BHK-21细胞中表达。
关键词：
水貂 犬瘟热病毒 F基因 真核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨应丽 杨兵 赖平安 王金洛 徐福洲
采用RT-PCR方法自犬瘟热病毒Lederle株基因组RNA中扩增出H基因(1 911 bp)和N基因(1 707 bp)片段,序列测定和分析表明与Onderstepoort株、CDV3株等疫苗毒株的同源性在95%以上,而与野外分离株的同源性介于90%～95%;以获得的H,N全基因片段为模板,分别扩增H基因近3′端996 bp的基因片段以及N基因中间高度保守区562 bp的基因片段,经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行表达,结果显示H片段和N片段分别表达大小约为57 kD和37 kD的融合蛋白,Western blotting检测结果显示,表达蛋白均可与CDV抗血清发生阳性反应...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李红丽 詹丽娥 乔忠 王彩先 陆冰洋
将麻花鸡副黏病毒ZH-1株毒种接种于11日龄SPF鸡胚,收集48~96 h死亡的鸡胚尿囊液。参考已发表的鸡源副黏病毒F基因序列,设计并合成了一对特异性引物,用以扩增麻花鸡副黏病毒ZH-1株F基因,预期扩增的F基因片段包含完整的开放阅读框。通过RT-PCR扩增出麻花鸡副黏病毒ZH-1株F基因片段,琼脂糖凝胶电泳回收、纯化,得到F基因片段,经EcoRⅠ和SalⅠ消化,将F基因克隆进入PCI-neo载体,转化大肠杆菌DH5α,挑选菌落,经限制性核酸内切酶SalⅠ和EcoRⅠ双酶切及PCR鉴定,结果证明重组真核表达载体PCI-neo-F构建成功,为下一步在哺乳动物细胞Vero细胞中表达打下良好的基础。...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王青 张彦明 王选年 张改平 胡建和 杨苏珍 赵东 邢广旭 徐彦召 赵光辉 段艳华
应用PCR扩增出新城疫病毒F基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序。然后将NDVF基因与高效的真核表达载体pcDNA4/HisMax相连,构建NDVF基因重组真核表达质粒pc4F,采用Superfect转染试剂将pc4F瞬时转染COS-7细胞,应用细胞免疫组化法检测其在细胞中的表达情况。结果表明,F基因能够在COS-7细胞中成功表达。
关键词：
新城疫病毒 F基因 真核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郑增忍 王海霞 龚振华 张彦明 李葳 刘俊辉
针对水疱性口炎病毒(VSV)N基因设计特异性引物,在引物中分别加入EcoR 和Xho 酶切位点。RT-PCR扩增后得到目的基因,将其克隆到表达载体pET30c,连接产物转化于DH5α菌株,在含Kan+的平板上37℃培养24h,然后挑取白色菌落,鉴定为阳性者,转化于BL21菌株,再经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导获得高效表达。表达融合蛋白分子质量为53ku(目的蛋白大约47ku),同预期蛋白大小相近。Westernblot检测表明,其能与本病毒阳性血清发生特异性反应,表达蛋白有望成为有价值的VSV诊断抗原。
关键词：
水疱性口炎病毒 N基因 原核表达载体
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
涂亦娴 张馨玉 金华利 杨福 刘明羽 张富春 王宾
比较猪瘟病毒E2基因的真核表达质粒proVAX-E2n和pVP22-E2n体外表达效率以及体内的免疫效果,以从中选出高效的猪瘟病毒核酸疫苗。将上述表达载体转染Hela细胞进行体外表达后,用RT-PCR和间接ELISA法检测Hela细胞体内和体外表达产物;免疫6~8周龄昆明白小鼠,用间接ELISA法和MTS法检测小鼠血清中CSFV特异性IgG抗体水平以及脾脏中淋巴细胞增殖功能。结果表明2种E2重组质粒均能在Hela细胞中正确表达,且proVAX-E2n的E2蛋白表达量(OD值为0.575 4)明显高于pVP22-E2n(OD值为0.306 05)(P<0.05);proVAX-E2n刺激机体产生...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
苏春霞 苏鑫铭 张彦明 曹瑞兵 周斌 陈溥言
为进一步提高重组病毒的表达水平,用构建的含gB启动子和NDV F48E9株F基因的MDV CVI988株转移质粒载体pUS10F转染293T细胞,通过PCR和接免疫荧光(IFA)法研究了其在真核中的表达,并确定最佳的转染条件。结果表明,真核细胞中带有F基因,转移质粒载体已经进入细胞DNA;转染转移质粒载体 pUS10F后的293 T细胞所表达的NDV F基因产物抗原性较好,能够与抗NDV的标准血清反应。确定的最佳转染条件为:DNA 3μg／mL,转染后48 h外源基因在细胞中的表达量最高,在6孔板和96孔板中细胞数量分别以 2×105／孔和1×101／孔的转染效果最好。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
董建宝 谢芝勋 孙建华 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢志勤 谢丽基
设计1对特异性引物,采用PCR方法从pMD18-TCHIFN-γ重组载体中扩增得到广西三黄鸡γ-干扰素基因,然后将该基因克隆入含有绿色荧光报告基团EGFP的真核表达载体pEGFP-N1中,构建成pEGFP-N1CHIFN-γ重组质粒,PCR鉴定结果和测序结果均显示,γ-干扰素基因正确地插入到真核表达载体中。使用脂质体转染法将pEGFP-N1CHIFN-γ转染Vero细胞,荧光显微镜下成功地观察到绿色荧光,说明γ-干扰素基因成功表达。
关键词：
鸡γ-干扰素 绿色荧光 真核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
孙星虹 孙晓凤 孙雷雷 李兰
为研究小鼠Dazl基因的功能及探究Dazl基因过表达在干细胞向生殖细胞分化过程中的作用,采用RTPCR方法,从13.5 dpc雌性胎鼠卵巢中克隆出Dazl基因的全部编码区,测序正确后利用限制性内切酶将其连接到真核表达载体pc DNA3.1上。线性化后对小鼠成纤维细胞进行转染,qRT-PCR及Western Blot技术显示外源基因Dazl已经成功转染并表达。为研究Dazl基因的功能及干细胞向生殖细胞的诱导分化奠定了基础。
关键词：
Dazl基因 真核表达载体 转染
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王君玮 姜平 王志亮 张维 李林 赵永刚
为研究鼬科动物犬瘟热病毒(CDV)毒株的变异特性,对来自不同地区的貉、狐、貂的5个CDV分离株(其中HD-m、LN-m为貂源,HTp-r、THD1-r为貉源,HB-f为狐源)和1个CDV国内弱毒疫苗株(vCh)的N基因和部分H基因进行了核苷酸测序,并构建系统发生树。结果表明,5个分离株之间H基因核苷酸序列同源性均达到97.5%以上,而N基因为94.5%~99.8%。vCh与5个分离株的H基因和N基因核苷酸序列同源性普遍较低(H基因:90.5%~91.8%;N基因:90.9%~93.5%),而与国外疫苗株vCon和vOnder的H基因核苷酸同源性达96.8%和97.2%。分离株之间H蛋白氨基酸同...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
冉智光 童光志 张绍杰 王玉春 黄勇富
根据已发表的伪狂犬病毒（ＰｒＶ）的基因序列，在ＰｒＶｇＥ基因起始密码子和终止密码子的上、下游分别设计一对引物ＰＣＬ１和ＰＣＬ２，在ＰＣＬ１和ＰＣＬ２的５端分别加上ＫｐｎＩ和ＢａｍＨＩ位点，以ＰｒＶＭｉｎ－Ａ株ＤＮＡ为模板成功地扩增到约１．８ｋｂ的片段，经酶切鉴定为ＰｒＶｇＥ基因。将此ＰＣＲ产物以ＫｐｎＩ和ＢａｍＨＩ消化，回收后与经ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ酶解的ｐＵＣ１１９连接、转化，获得了明显大于载体的重组质粒，经限制性酶切和序列部分测定鉴定了阳性重组质粒ｐＲＺＥ。将ｐＲＺＥ分别经ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ酶切，回收ｇＥ基因，分别克隆到真核表达载体ｐＣＲ３－Ｕｎｉ和杆状病毒载体...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
吴春涛 王建华 侯相山 霍雷 侯艳梅 牛钟相
用PCR法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型B artha N u/67株gB基因,将其插入原核表达载体pBAD/TOPO中构建重组质粒pBAD-gB。将pBAD-gB质粒转化大肠杆菌TOP 10后进行了诱导表达,对表达产物进行了纯化和抗原性检测,并通过改变诱导剂L-A rab inose的浓度和诱导时间对诱导表达条件进行了优化。结果表明,重组质粒pBAD-gB构建成功,gB蛋白获得了高效表达,并以包涵体形式存在,纯化后gB蛋白的纯度达90%以上,gB蛋白抗原性良好,最佳诱导表达条件:L-A rab inose终浓度为0.2 g/L,诱导时间为5 h。
关键词：
牛疱疹病毒Ⅰ型 gB基因 原核表达
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
乔艳艳 杨翠云 于翠 曹洁 马青 张丽莉
根据烟草环斑病毒外壳蛋白(TRSV-CP)基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法,获得烟草环斑病毒基因组中编码外壳蛋白部分基因片段,将其插入原核表达载体pET28a中,获得重组表达质粒pET-CP,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导蛋白大量表达。重组蛋白经过Ni+-NTA纯化后,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,TRSV-CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,产生的融合蛋白分子质量约为34 ku,并具有免疫学活性。以纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,多抗血清效价达1∶409 600,可以与重组蛋白发生抗原抗体反应。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
邓明俊 张彦明 梁荣 段明星
为进一步研究基因疫苗的免疫机制和基因疫苗的免疫效果 ,应用 DNA重组技术 ,根据载体 pc D-NA4 .0 / His Max的多克隆位点设计引物 ,对含有 NDV保护性抗原基因 F的质粒 PCR扩增。将得到的目的片段插入到载体的启动子下游 ,成功得到含有 NDV F基因的真核表达质粒载体 PC4 F的基因疫苗。
关键词：
鸡新城疫病毒 F基因 基因疫苗
[期刊] 华北农学报
[作者]
苑博华 蒋继志 刘红梅
分别以质粒pBV221和pPIC9K为表达载体,成功构建了PRRS病毒E基因克隆载体,转化后经抗性筛选、PCR扩增、双酶切鉴定,确认得到了含有目的基因的阳性克隆。对含有E蛋白原核表达载体的阳性克隆进行诱导表达,经过酶联免疫鉴定,结果显示外源蛋白在宿主菌中有表达,成功实现了在大肠杆菌细胞中的克隆。本研究成功构建了PRRSV BJ-4毒株E基因的原核表达载体和真核表达载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。
关键词：
PRRSV 基因克隆 原核表达 真核表达
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