【目的】克隆与表达牦牛β-防御素5(BNBD5)基因,检测其重组蛋白的体外抗菌活性。【方法】采用RT-PCR方法从牦牛肺组织中扩增BNBD5基因成熟肽编码区,根据已发现的哺乳动物β-防御素5和部分禽β-防御素5的序列构建遗传进化树。将BNBD5基因亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)的BamHⅠ和XhoⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒pET32a-BNBD5。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG于37℃进行诱导表达,SDSPAGE检测融合蛋白的表达情况,并对该重组蛋白进行纯化,测定其体外抑菌活性。【结果】克隆得到了BNBD5基因成熟肽编码片段,其长度为138bp,编码45个氨基酸...

【目的】克隆和表达新疆荷斯坦牛中性粒细胞防御素5(BNBD5)基因,对BNBD5蛋白进行纯化并分析其抗菌活性。【方法】利用RT-PCR方法扩增新疆荷斯坦奶牛BNBD5的cDNA序列,将BNBD5 cDNA克隆到原核表达载体pGEX-4T-2,测序分析后转化大肠埃希菌BL21(DE3)。经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析;利用GST亲和柱纯化BNBD5蛋白,并进行体外抑菌试验。【结果】通过PCR扩增获得了218bp的牛BNBD5全长cDNA序列,经IPTG诱导,获得了约33 ku的牛BNBD5蛋白。牛BNBD5蛋白在15~25℃培养时的可溶性较...

【目的】从鸭组织中克隆鸭β-防御素(AvBD)2基因,在大肠杆菌中高效表达,检测重组鸭AvBD2蛋白的生物学特性。【方法】应用RT-PCR技术从鸭胰腺组织中扩增鸭AvBD2基因,根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素-2的氨基酸序列构建系统进化树,将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达,对该重组蛋白进行纯化,测定体外抗菌活性与理化特性。【结果】鸭胰腺组织中克隆出鸭AvBD2基因的cDNA大小为195bp,编码64个氨基酸。同源性分析表明,鸭AvBD2与其它物种AvBD2同源性较高。凝胶电泳结果显示重组鸭AvBD2蛋白在原核高效表达(分子量约为32kD),...

【目的】克隆和表达鸡β-防御素3(Gal-3)基因,并对其抑菌活性进行研究,为寻找替代抗生素的抗菌肽提供试验依据。【方法】利用RT-PCR方法,从鸡心脏中分离并克隆了鸡Gal-3基因,将其与分子伴侣基因SUMO相融合,再将该融合基因与原核表达载体pET-20b连接后转化至BL21(DE3)宿主细胞中,经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析;最后,对Gal-3融合蛋白进行纯化,并对表达产物进行体外抑菌试验。【结果】通过RT-PCR扩增获得了约240bp的鸡Gal-3基因,经IPTG诱导获得约26ku的蛋白。IPTG在终浓度为0.6mmol/L,33℃诱导4...

【目的】实现荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组BNBD12的抗菌活性。【方法】RT-PCR扩增荷斯坦牛中性粒细胞BNBD12基因,序列分析后人工合成了适于在大肠杆菌中表达的BNBD12成熟肽,构建原核表达载体pET32a(+)/BNBD12,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。通过琼脂扩散法分别确定重组蛋白对牛源乳腺炎主要致病菌革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌效果,应用扫描电镜观察重组蛋白的杀菌效应。【结果】测序结果表明扩增片段长度为180bp,可编码含60个氨基酸的成熟蛋白。SDS-PAGE和Western blotting分析显示人工合成的BN...

【目的】构建黄沙鳖β-防御素1(Hs-BD1)原核表达并分析其抗菌活性，为深入分析Hs-BD1的生理功能及开发新型黄沙鳖抗菌药物提供理论依据。【方法】构建Hs-BD1成熟肽序列的重组表达载体pCold-TF-Hs-BD1，采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白rHs-BD1表达，以十二硫酸酯钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blotting)检测重组蛋白rHs-BD1的表达情况。采用Ni柱亲和层析法对重组蛋白rHs-BD1进行纯化，分析其对几种革兰氏阳性和阴性菌的抑菌活性、溶血性和抗氧化能力。【结果】SDS-PAGE检测结果显示，重组蛋白rHs-BD1在电泳凝胶约58.1 kDa处出现特异性条带，其分子量大小与预测值相符。经Western blotting检测，重组蛋白rHs-BD1可与Anti-6×His Tag抗体发生特异性反应，表明Hs-BD1基因在原核表达系统成功表达，经纯化的重组蛋白rHs-BD1含量为400.0 μg/mL。对已纯化的重组蛋白rHs-BD1进行体外抗菌活性检测，结果显示其对无乳链球菌(Streptococcus agalactiae) HPG1和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)HPN1的最小抑菌浓度(MIC)为40.00 μg/mL，对大肠杆菌(Escherichia coli)YLG1、类志贺邻单胞菌( Plesiomons shigelloides)DAL1和迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)FCH1的MIC为20.00 μg/mL，表明重组蛋白rHs-BD1对一些革兰氏阳性和阴性菌具有较强的抗菌活性。20.0、40.0、60.0和80.0 μg/mL重组蛋白rHs-BD1对新鲜黄沙鳖血细胞的溶血率分别为1.5%、2.7%、3.3%和4.2%，20.0、40.0、80.0和120.0 μg/mL重组蛋白rHs-BD1对1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基的清除率分别为2.6%、5.2%、11.6%和17.0%。【结论】经原核表达获得的Hs-BD1重组蛋白rHs-BD1具有一定的广谱抗菌活性和抗氧化能力，且溶血作用较弱，对黄沙鳖机体毒副作用较低，可用于新型黄沙鳖抗菌药物开发。

【目的】从鸭组织中克隆鸭β-防御素9(AvBD9)基因,在原核表达重组鸭AvBD9蛋白;研究重组鸭AvBD9蛋白的体外抗菌活性与理化特性。【方法】采用RT-PCR法,从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD9基因,测定该基因在鸭各组织器官中的分布;将鸭AvBD9基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒pGEX-duckAvBD9,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达;亲和层析纯化蛋白,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定重组鸭AvBD9蛋白的体外抗菌活性与理化特性。【结果】从鸭肝脏组织中克隆得到鸭AvBD9基因,序列分析表明该基因大小为204bp,前体肽包括67个氨基...

根据GeneBank中牛TAP的序列设计了1对特异性引物,采用RT-PCR方法从牛气管组织扩增牛TAP基因,并克隆到pEASY-T3载体。测序结果表明,扩增的片段含有144 bp核苷酸,编码48个氨基酸,与已报道的bTAP有1个氨基酸不同。该基因与真核表达载体FG9重组,经过PCR,酶切和测序鉴定,筛选牛TAP基因重组真核表达载体。使用脂质体法将FG9-TAP重组质粒转染293T细胞,斑点ELISA检测结果表明,成功构建了高表达牛TAP基因的真核表达载体,为抗金黄色葡萄球菌转牛TAP基因奶牛培育研究奠定基础。

为了探讨重组犬溶菌酶的活性及临床应用前景,人工合成犬溶菌酶基因,构建其原核重组表达载体pPROHTa-rcLYZ,进行原核表达并对表达产物进行活性分析。结果表明,合成的犬溶菌酶基因全长396 bp,编码132 aa;构建的表达载体pPROHTa-rcLYZ含有犬溶菌基因完整的ORF;重组犬溶菌酶的相对分子质量为16 ku;重组犬溶菌酶约占全菌总蛋白32％,纯化后占全菌可溶性蛋白的95％;重组犬溶菌酶最适pH值为6．2,最适温度为38℃,对溶壁微球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有较强的溶菌活力,对铜绿假单胞菌、链球菌、枯草杆菌等有一定的抑制作用,对白色念珠菌无抑制作用,对人工感染的犬大肠...

采用PCR方法对所克隆的斑节对虾溶菌酶基因的cDNA进行改造,并克隆至含温控启动子PRPL的大肠杆菌表达质粒pBV220,构建斑节对虾溶菌酶表达载体pBV220 lyz。该质粒转化大肠杆菌后经42℃诱导表达。SDS PAGE电泳表明,表达产物中有16kD左右的特异性条带,与预期斑节对虾溶菌酶分子量相符。薄层扫描显示,重组斑节对虾溶菌酶约占全菌总蛋白的32%,纯化后的重组斑节对虾溶菌酶占全菌可溶性蛋白的90%左右。比浊法检测复性后产物的生物活性,结果表明重组斑节对虾溶菌酶的最适pH为6.0,最适温度为40℃。测定了重组斑节对虾溶菌酶对溶壁微球菌和几种鱼病原菌菌株的溶菌活力,结果表明,重组斑节对虾...

【目的】从鹅的组织中克隆鹅β-防御素10(avianβ-defensin 10,AvBD10)基因,通过大肠杆菌进行原核表达,检测重组鹅AvBD10蛋白的生物学特性。【方法】采用RT-PCR方法,从鹅的肾脏组织中扩增鹅AvBD10基因。根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建系统进化树,进行遗传进化分析;并应用荧光定量的方法对该基因的组织表达水平进行鉴定。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达,并对该重组蛋白进行纯化,测定体外生物学活性。【结果】从鹅肾脏组织中克隆出了鹅AvBD10基因,该基因的cDNA大小为207 bp,编码68个氨基酸。经遗传进...

褶纹冠蚌(Cristaria plicata)样本壳长(9.50±1.05)cm、壳高(6.45±0.81)cm,暂养1周。40只随机分成试验组和对照组,每组20只。用Trizol法提取经诱导刺激后0、6、12、24、36、48 h的血液、外套膜、鳃、肝胰腺组织RNA,构建褶纹冠蚌cDNA文库并从中获得防御素基因cDNA全长序列。结果表明,褶纹冠蚌防御素序列全长为514 bp,其中5’UTR有57 bp;3’UTR有242 bp,含有一个poly(A)尾;开放阅读框长度为192 bp,编码63个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白N端为1个由23个氨基酸构成的信号肽,成熟肽由40个氨基酸组成,理论等电点...

【目的】大多数的植物防御素对不同的病原菌具有抗菌活性,其中来自苜蓿种子的防御素alfAFP的转基因土豆和番茄已经被证明对病原菌具有强抗病性。进一步研究该基因对稻瘟病、纹枯病、白叶枯病三大重要病害的抑制作用,对水稻抗病基因工程研究具有重要的意义。【方法】本试验将alfAFP构建到表达载体pPIC9K上,电转化毕赤酵母(GS115),再进行蛋白质的分泌性诱导表达,最后进行体外重组蛋白对水稻病菌的抑菌活性检测。【结果】通过15%的SDS-PAGE检测,得到大约6.5kD的重组蛋白。alfAFP融合蛋白对水稻纹枯病、稻瘟病和白叶枯病均具有一定的抑制活性,其中对纹枯病的作用最为明显。【结论】alfAFP...

【目的】在紫花苜蓿中表达鸡β-防御素3(Gal-3),为利用紫花苜蓿规模化生产Gal-3奠定基础。【方法】PCR扩增鸡Gal-3基因,以潮霉素作为转基因植物的选择标记,将鸡β-防御素Gal-3基因克隆至表达载体pCAM-BIA1390R(简写为p1390R)上,构建重组表达质粒p1390R-Gal-3;采用冻融法将质粒p1390R-Gal-3转入根瘤农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化至紫花苜蓿;采用PCR检测、Southern blot筛选阳性转基因苜蓿植株,并对Gal-3蛋白进行抑菌活性研究。【结果】PCR扩增获得了240bp的鸡Gal-3基因,成功构建植物表达载体p1390R-Ga...

β-防御素是一类富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,在脊椎动物免疫系统中发挥重要作用。本研究基于转录组Solexa测序结果,利用PCR和荧光定量PCR技术对俄罗斯鲟(Acipenser gueldenstaedti)β-防御素基因进行了克隆和表达模式分析。结果显示,俄罗斯鲟β-防御素cDNA片段长度为333 bp,包含开放阅读框(Open reading frame,ORF)213 bp,推测编码71个氨基酸;SMART分析表明,该基因包含23个氨基酸的信号肽,1个防御素-beta-2结构域,6个保守的半胱氨酸残