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[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
贾添慧 董蕾 王永杰 喻勇新
为了解决目前巢式PCR法检测牡蛎样品中GⅡ型诺如病毒时存在的非特异性扩增、假阴性等问题，本研究对NCBI数据库中在线获得的所有GⅡ型诺如病毒序列进行系统分析，重新设计出针对GⅡ型诺如病毒检测的通用型巢式PCR引物（NG2OF/NG2OR），并从基因型覆盖度、特异性、灵敏度和实际样品检测的稳定性几个方面对新设计的引物进行评估。结果显示：（1）新引物的特异性好，只对GⅡ型诺如病毒进行有效扩增，且不受牡蛎样品本底的影响。（2）新引物灵敏度高，最低可检测至26.4个拷贝。（3）在对92个牡蛎样品进行检测时，新引物的阳性检出率为28.3%，比经典引物高出7.5%。因此，新建立的GⅡ型诺如病毒巢式PCR检测方法在检测牡蛎样品时特异性更强，灵敏度更高，为牡蛎中诺如病毒的检测提供了一种新的、可靠的技术手段。
[期刊] 水产学报
[作者]
高文辉 白昌明 蔡生力 王崇明
为了建立适用于Ｏｓ ＨＶ－１不同变异株的检测方法，在牡蛎疱疹病毒（Ｏｓ ＨＶ－１）３个变异株全基因组序列比对的基础上，筛选到牡蛎疱疹病毒基因组中高度保守的ＤＮＡ聚合酶（ＤＮＡ ｐＯｌｙｍｅｒＡｓｅ）基因，据此设计巢式ｐＣｒ引物，优化ｐＣｒ反应体系和条件，建立了基于Ｏｓ ＨＶ－１ ＤＮＡ聚合酶基因的巢氏ｐＣｒ检测方法（ｐ－Ｎ ｐＣｒ检测方法），利用ｐ－Ｎ ｐＣｒ与ＣＮ ｐＣｒ检测方法对不同年份和宿主来源的Ｏｓ ＨＶ－１疑似感染样本进行检测。结果显示，ｐＮ ｐＣｒ检测方法能稳定地检出１００拷贝／μｌ的病毒ＤＮＡ；ｐ－Ｎ ｐＣｒ较Ｃ－Ｎ ｐＣｒ检测方法具有更强的特异性和更高的检出率。研究表明，本研究．．．
[期刊] 中国水产科学
[作者]
汪俊 薛长湖 李兆杰 蔡跃飘 何闪闪 杨文鸽
利用pH9.5的甘氨酸缓冲液性处理太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)匀浆液,PEG沉淀病毒粒子的方法对未知的是否污染有诺瓦克样病毒(Norwalk-like Virus,NLVs)的牡蛎样品进行处理,并提取病毒RNA,进行RT-PCR,凝胶电泳检测扩增结果。初步建立了牡蛎中NVLs的检测方法。纯化所得的特异PCR产物,克隆到T-载体中,筛选转化子,提取质粒,并进行PCR电泳鉴定。重组质粒序列测定结果在NCBI上进行BLASTn显示所得产物与已发表的诺瓦克样病毒的相应序列具有极高的同源性(>95％);根据Genebee在线分析系统AliBee-Multiple Alignment进...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张旻 林祥梅 江育林
蛙虹彩病毒属(Ranavirus)病毒宿主广泛,可以感染爬行类、鱼类和两栖类,大部分病毒对宿主都有较强的致病性和致死性。为建立一种快速高效的蛙虹彩病毒的检测方法,本研究利用中华鳖虹彩病毒(Soft-shelled Turtle Iridovirus,STIV)核衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因保守区设计内引物和外引物,建立了特异性检测流行性造血器官坏死病毒(Epizootic Haematopoietic Necrosis Virus,EHNV)、中华鳖虹彩病毒和虎纹蛙虹彩病毒(Tiger Frog Virus,TFV)的巢式PCR(巢式PCR)检测方法,并制备...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
曲梦 江艳华 李风铃 姚琳 逄凤娇 王联珠 翟毓秀
RNA提取是诺如病毒检测的关键步骤,而目前贝类中诺如病毒RNA提取、检测方法的比较与评价常囿于缺乏量值明确、无生物安全隐患的标准样品作为参考依据。本研究将前期制备的GⅡ型诺如病毒装甲RNA (3.0×10~(10)拷贝)作为标准样品,人工污染牡蛎(Ostrea gigas tnunb)消化腺匀浆物,用4种常见RNA提取方法:TRIzol试剂、Viral RNA Kit、High Pure Viral Nucleic Acid Kit、柱式病毒RNAOUT试剂盒,分别提取RNA,经实时荧光RT-PCR检测后,利用标准曲线进行定量分析,分别计算4种方法对装甲RNA的回收率。结果显示,对于匀浆样本,TRIzol法对装甲RNA的回收率最高(6.80±0.89)%,显著高于Viral RNA Kit (4.51±2.28)%,二者的回收率又显著高于High Pure Viral Nucleic Acid Kit (0.24±0.05)%与柱式病毒RNA_(OUT)试剂盒(0.11±0.02)%(P
[期刊] 水产学报
[作者]
李亚楠 白昌明 刘金兰 辛鲁生 李晨 刘莉 黄博闻 魏智薪 王崇明
为建立实现牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在贝类宿主组织中的精确定位方法,基于原位杂交PCR (ISPCR)技术建立了OsHV-1的间接原位杂交PCR (indirect ISPCR)检测方法,并利用该方法对OsHV-1在魁蚶主要器官的分布情况进行了检测和分析。首先选择适合原位杂交PCR的引物,在载玻片上实现对原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增,然后与使用相同引物制作的地高辛标记核酸探针进行原位杂交,最后通过免疫酶标技术显示样本内OsHV-1的组织分布。为了达到最佳检测效果,对间接ISPCR的扩增循环数以及组织消化的蛋白酶K浓度进行优化。结果显示,最适PCR扩增循环数为20,蛋白酶K浓度为20μg/mL。利用经优化的间接ISPCR检测方法,对OsHV-1在魁蚶外套膜、鳃、肝胰腺、斧足和闭壳肌5个样本中的组织分布情况和亲嗜性进行检测和分析。病毒阳性信号主要分布于魁蚶外套膜结缔组织中浸润的血细胞和成纤维细胞、肝胰腺和鳃浸润的血细胞、斧足和闭壳肌中坏死肌肉细胞的细胞核中。本研究建立的间接ISPCR检测方法具有灵敏、特异和精确定位的优点,通过组织切片上显示的病毒核酸阳性信号,能判别OsHV-1在不同组织部位的分布特点和受感染的细胞类型;适用于OsHV-1感染的确诊、病毒对不同组织器官的亲嗜性、病毒侵染途径和致病机理等相关研究。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
童桂香 黎小正 卢小花 廖永志 江林源 韦信贤
罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)是世界动物卫生组织规定必需上报的罗氏沼虾白尾病(whitetail disease,WTD)的主要病原体。为建立快速检测MrNV的套式RT-PCR方法,根据GenBank上发表的MrNV衣壳蛋白基因序列设计2对特异性引物,对PCR条件进行优化后通过特异性试验和敏感性试验检测其特异性和敏感性。结果表明:该方法能特异性地扩增出205 bp的MrNV衣壳蛋白基因片段,最佳引物浓度为0.8μmol/L、退火温度为56℃、Mg2+浓度为2.0 mmol/L,而对其他对虾病毒基因组均没有扩增出条带;检测Mr...
[期刊] 水产学报
[作者]
李晨 王崇明 曲朋 黄倢
为更好地实现对养殖海区栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)的快速诊断和分子流行病学的调查,以及AVNV的疫情监测,选择AVNV全基因组序列中的保守区段,应用Accelrys gene 2.5软件设计一对巢式引物,用于AVNV的检测。结果显示,引物的扩增片段分别为979和548 bp。实验优化了PCR体系中Mg2+和dNTPs浓度及扩增程序中的退火温度,并建立了完善的AVNV巢式PCR检测技术。研究表明,该PCR检测技术具有较高的敏感性,可稳定检测出5 pg扇贝样品组织总核酸中5×10 copies的病毒粒子。
关键词：
栉孔扇贝 急性病毒性坏死病毒 巢式PCR
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张迪 杨铿 苏友禄 冯娟 郭志勋
青蟹呼肠孤病毒(mud crab reovirus,MCRV)和青蟹双顺反子病毒-1(mud crab dicistrovirus-1,MCDV-1)是从近年发生大规模死亡的养殖拟穴青蟹体内分离的、对青蟹具有致病性的两种病毒。它们常常同时存在,给青蟹养殖业带来巨大经济损失。在疾病的防治中,快速高效的病毒检测方法对疾病诊断以及及时采取有效地防治措施具有重要的意义。本研究利用MCRV和MCDV-1基因保守区设计4对引物,建立了可同时检测这两种病毒的双重巢式PCR(duplex-nested PCR)检测方法。研究发现该方法对两种病毒的检测限都可以达到10个拷贝,并与鲍肌肉萎缩病毒(AbSV)、虾类...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
陈垚 陈信忠 郭书林
应用聚合酶链式反应(PCR)方法对福建、广东和海南等地沿海的养殖牡蛎进行包拉米虫、派琴虫和单孢子虫检测.结果表明,这些地区的牡蛎均不同程度地感染这些原虫,经鉴定病原为牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫.根据基因库中奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫的基因序列设计多对特异性引物,检测包拉米虫的引物采用世界动物卫生组织推荐引物,通过对多重PCR反应条件的优化,建立可同时检测这3种原虫的多重PCR方法.运用该方法对样品中的牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫进行扩增,结果得到与试验设计相符的303、480和749 bp 3条特异性扩增条带,对其他贝类病原核酸的扩增均为阴性.多重PCR方法最低能检测...
[期刊] 水产学报
[作者]
罗明菊 李宁求 林强 牛银杰 刘礼辉 梁红茹 罗霞 付小哲
为有效预防大口黑鲈双RNA病毒(largemouth bass birnavirus, LBBV),实验针对LBBV保守基因VP1设计特异性引物,构建重组质粒pMD-LBBV-VP1,通过优化PCR反应条件,提高检测方法的灵敏度和特异性,建立了大口黑鲈双RNA病毒的巢式RTPCR检测方法,并采用该方法对实验室2017—2020年收集的304株样本进行检测。结果显示,巢氏引物F1/R1、F2/R2最佳工作浓度均为4×10~(-12) mol,最佳退火温度分别为64.1℃和61.5℃,当巢氏RT-PCR扩增35个循环时,可以检测质粒最低浓度为4.15个/μL拷贝数,最低模拟样品浓度为10~2 PFU/mL,与第1轮PCR相比,灵敏度均提高了10 000倍,同时检测9种不同病毒,仅LBBV出现明亮特异性条带,在304个样品中,第1轮PCR检出阳性样品14株,检出率为4.60%,巢式RT-PCR检出阳性样品28株,检出率为9.21%;本实验建立的巢式RT-PCR检测方法灵敏度高且特异性好,可用于LBBV的早期检测及防控。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱小甫 张志 李晓成 陈德坤 吴旭锦
为了优化猪瘟病毒的RT-nested PCR检测方法,对福建省猪瘟流行情况进行了调查。根据GenBank上发表的猪瘟病毒Shimen株基因序列设计并合成了2对引物,优化了猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的RT-nested PCR检测方法,并对所优化的RT-nested PCR特异性进行了检验。结果表明,该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为1×10-7ng/mL,只有CSFV扩增出了272 bp的目的条带,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)阳...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
赵欣 贾鹏 刘莹 王津津 史秀杰 潘广 郑晓聪 于力 何俊强 刘荭 吴志新
本研究建立了定量检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,并与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法的灵敏性、重复性、特异性和临床样品检测做了比较分析。结果表明,与qPCR相比,ddPCR具有相同的特异性,其灵敏性比qPCR低20倍。在定量CyHV-2 DNA时,ddPCR(R2=0.994)和qPCR(R2=0.994)均表现出良好
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
周智君 陈军 俞远京 肖献忠
根据GenBank登录的兔出血症病毒的VP60基因序列,设计了2对引物,建立了检测兔出血症病毒的套式PCR检测方法.先用外引物扩增一段389bp的DNA片断,继而用内引物以扩增产物为模板进行第2次扩增(即套式PCR),以提高结果的准确性,避免一次性PCR的假阳性结果.用该方法对12份RHD样本进行检测,检出率为100%.
关键词：
兔出血症病毒 套式PCR VP60基因
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
曹胜波 陈焕春 肖少波 何启盖 徐引弟 刘军发
根据国外已发表的猪环状病毒 2型 (PCV 2 )的全基因组序列 ,设计一对 2型特异性引物 ,对可疑病料进行PCR扩增。将扩增产物连接到pMD 18 T载体上并克隆到大肠杆菌DH5α中 ,经提取质粒进行PCR、酶切、测序鉴定 ,证明扩增出了PCV 2的目的片段。将测序结果与GenBank收录的PCV 2序列进行比较 ,发现同源性均在90 %以上。用该PCR方法在 43份可疑病料中检测到了 12份PCV 2阳性病料 ,表明该病在我国已有流行
关键词：
猪环状病毒2型 检测方法 聚合酶链反应
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