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[期刊] 中国水产科学
[作者]
林强 李宁求 付小哲 刘礼辉 石存斌 吴淑勤
以副溶血弧菌毒素调控基因(toxin regulations,toxR)作为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,以含toxR基因的质粒为模板,建立质粒拷贝数与CT值的标准曲线,分别采用含toxR基因质粒、纯培养的副溶血弧菌和添加副溶血弧菌的牡蛎(Ostrea)模拟样品进行灵敏度试验,结果表明,其灵敏度分别为15拷贝、18 CFU/mL和180 CFU/mL。同一个样品的30次重复性试验表明,试验内及试验间的变异系数分别为0.95%和1.5%。结果显示,本研究建立的副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牡蛎等水产品中副溶血弧菌的定量检测。
关键词：
副溶血弧菌 荧光定量PCR toxR基因
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
李昊 张铭洋 于永翔 王印庚 张正 马翠萍 陈夫山
急性肝胰腺坏死病(AHPND)是对虾养殖过程中最常见、最严重的疾病，给对虾养殖造成重大经济损失。AHPND病原种类多、基因型复杂，现有的针对不同病原的检测技术目标导向较弱、检测成本高、时间消耗长，对虾健康养殖亟待开发AHPND的精准快速诊断技术。本研究针对AHPND病原体携带编码一种二元毒素pirA和pirB大型质粒的遗传共性，基于pirA和pirB基因设计特异性引物并建立微流控荧光定量PCR检测方法。该方法对致病基因pirA和pirB特异性强、灵敏度高，最低检测限分别为5.43×10~0和4.31×10~1 copies/μL，样品平均检测时间为26min左右。为进一步评估该方法在实际应用中的准确性，以含有pirA和pirB毒性质粒的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行人工感染实验。结果表明，感染后的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃丝、肝胰腺、肠道和肌肉等组织随时间的推迟均能检测到pirA和pirB；从感染2h的结果来看，pirB比pirA检出率更高。此外，致病因子pirA和pirB比toxR的检出率更高，更适合对AHPND致病原的检测。本研究建立的微流控荧光定量PCR检测的方法具有快速、灵敏、高通量、污染少、现场检测、一体化集成等优点。该技术不仅适用于实验室，更符合养殖基层的现场快速检测需求，为及早认知疾病发生风险和病害精准防控提供了新的技术手段与理论支撑。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
吕淑霞 祝儒刚 刘月萍 张喆 胡英
建立扩增内标存在下同时检测副溶血弧菌tlh基因和trh基因的多重PCR方法。以细菌16SrDNA片段为扩增内标对照(internal amplification control,IAC),副溶血弧菌不耐热溶血毒素(thermolabile hemolysin,TLH)基因tlh和相对耐热直接溶血毒素(thermostable related hemolysin,TRH)基因trh为检测基因,设计引物,并优化多重PCR体系。特异性及灵敏度试验结果表明:该多重PCR体系检测致病性副溶血弧菌表现出极好的特异性。纯培养条件下,扩增内标存在时tlh基因和致病基因trh的检测灵敏度分别为1.3×102 c...
[期刊] 水产学报
[作者]
林强 李宁求 付小哲 刘礼辉 石存斌 吴淑勤
为了研究牡蛎养殖过程中副溶血弧菌与水质因子之间的关系,2009年3月到11月从广东阳西某牡蛎养殖场采集牡蛎样品检测其副溶血弧菌的感染情况,并检测水体温度、盐度、pH和溶解氧。实验结果表明:副溶血弧菌总量的检出率为94.38%。水温和副溶血弧菌总量呈正相关,盐度和副溶血弧菌总量呈负相关,pH和溶解氧与副溶血弧菌总量的相关性不明显。对水温和盐度与副溶血弧菌总量的对数进行回归分析,水温和副溶血弧菌浓度的拟合回归方程为LgVP=0.093T-0.685(R2=0.336);盐度和副溶血弧菌浓度的拟合回归方程为LgVP=1.199+0.116S-0.004S2(R2=0.217);水温和盐度对副溶血弧菌...
关键词：
牡蛎 副溶血弧菌 水质因子
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
童桂香 黎小正 吴祥庆 黄鸾玉 黄光华 韦信贤
根据pir AVp基因保守序列设计特异性引物和TaqMan–MGB探针,经优化反应体系及条件,建立检测致对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)的TaqMan–MGB探针荧光定量PCR方法;以重组质粒为标准品制作标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。结果表明:该方法定量范围宽,起始模板浓度范围为1×101～1×109拷贝/反应时,标准曲线具良好的线性关系;最低检测限约为10拷贝/反应,与对虾其他病原菌及病毒无交叉反应,重复试验变异系数为0.37%～0.47%,可在1 h内完成单个样品检测;对临床对虾样品及水样的检测结果表明,与世界动物卫生组织(OIE)推荐的套式PCR法相比,可提高VpAHPND的阳性检出率,且检测为阳性的样品包含全部套式PCR法检测为阳性的样品。可见,应用TaqMan–MGB探针建立的检测VpAHPND的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、能快速定量等优点,可用于临床对虾样品及水样的VpAHPND检测。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
张海强 安伟 肖雨
为了监测上海市养殖对虾中副溶血弧菌致病基因的携带情况及潜在致病株流行情况,采用PCR方法对上海地区不同对虾养殖单位中分离获得的19株副溶血弧菌分离株及1株标准菌株进行6种致病基因的检测筛查,并采用ERIC-PCR方法进行基因分型分析。结果发现:19株副溶血弧菌中未检测出携带tdh、ORF8基因,只有1株携带trh基因,而tox RS/new基因携带率较高,19株中有14株检出阳性,基因携带率为73.7%。对能够引起对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的副溶血弧菌特异性质粒基因的检测中发现,AP1和AP2基因均有3株检测出阳性,基因携带率均为15.8%。通过ERIC-PCR分型技术将20株副溶血弧菌分成7个不同的类群,其分辨力指数DI值为0.811,表明ERIC-PCR具有较好的基因分型能力,分型结果发现该方法能够有效区分不同时间段获得的菌株,而对不同地理位置获得的菌株区分并不明显。以上结果表明从养殖对虾中分离得到的副溶血弧菌致病基因携带率总体偏低,但存在一定的流行风险,需要防范一些新的致病株的流行,这些可以为对虾养殖单位中副溶血弧菌致病流行株的预防控制提供相关参考。
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘代新 宁喜斌
运用PCR技术成功建立了检测产耐热直接相关溶血素(TRH)的副溶血性弧菌的方法,并应用该方法从1株标准株和其他3种不同来源的37株副溶血性弧菌中的13株扩增出0.5 kb的trh基因特异性扩增带;产TRH的副溶血性弧菌中1株标准株,12株分离自腹泻病人排泄物或呕吐物,1株分离自水产动物养殖用水;并且产TRH与尿素酶阳性的副溶血性弧菌菌株之间的具有一一对应的关系,结果认定尿素酶阳性是产TRH的副溶血性弧菌菌株的表现型。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
刘衍鹏 黄冠军 刘天强 李爱华 肖丹
根据弧菌属细菌(Vibrio spp.)共有的rpo A基因序列,比对和设计了一对PCR引物,建立了能够快速而准确地检测弧菌属细菌的通用PCR检测方法,该方法对靶标DNA的检测灵敏度为58 fg/μL,对菌液的检测灵敏度为2.7×102cfu/m L,能够区分该属细菌与其它属的细菌,具有极高的特异性。使用建立的方法对分离自南美白对虾的病原菌进行了检验,并结合16S r DNA序列分析,结果显示待检测病原均为弧菌属的细菌,与测序结果一致,说明该检测方法可用于弧菌属细菌的检测和诊断。
关键词：
弧菌属细菌 rpo A基因 特异性 检验
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈利达 袁军海 李磊 石延霞 柴阿丽 谢学文 李宝聚
为了建立一种快速检测镰孢菌属的方法。根据Fusarium翻译延伸因子(TEF-1α)基因序列,设计并筛选其特异性引物F8-1/F8-2,能从靶标基因组DNA中特异性扩增出大小为187 bp的目的片段,建立Fusarium荧光定量PCR(RT-PCR)检测体系的灵敏度比常规PCR高104倍,且特异性良好。利用该反应体系检测不同湿度环境下病残体和土壤病残体DNA含量的动态变化。结果表明:病残体及土壤病残体DNA初始拷贝数分别为6. 90×10~(11),1. 06×10~(12)拷贝数/g,经过温度27℃、80%湿度下处理30 d病残体DNA含量下降至5. 55×10~8和0拷贝数/g,而在温度27℃、20%湿度下含量分别为8. 04×10~9,1. 30×10~9拷贝数/g。因此,建立的Fusarium实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速准确地定量检测病残体DNA的含量,为瓜类根腐病的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。
关键词：
镰孢菌 实时荧光定量PCR 湿度 病残体
[期刊] 西南农业学报
[作者]
贺晓晨 韩书煜 黎姗梅 胡大胜 黄德生 吴伟锋 黄钧 梁静真 胡庭俊
【目的】检测广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌的耐药性和整合子—基因盒携带情况,为凡纳滨对虾副溶血弧菌病的防控及该菌耐药分子机制研究提供基础数据。【方法】采用K-B纸片扩散法测定副溶血弧菌对16种抗菌药物的敏感性;采用PCR检测I、II和III型整合子及I型整合子可变区基因盒的携带情况,并分析菌株整合子—基因盒携带情况与耐药性的相关性。【结果】104株广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌对16种抗菌药物表现出不同程度的敏感性,其中,对氟苯尼考(FFC)的敏感性最高,敏感率达82.7%;对磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺二甲嘧啶(SM2)和复方磺胺嘧啶(SD)的耐药性较强,耐药率达93.3%～100.0%。在2013-2018年,广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌共有20种耐药谱,其中优势耐药谱为SD/SM2/SMM/SMD/SXT/RAD。PCR扩增结果表明,I型整合酶int1基因检出率为64.4%,sul1和qacEΔ1基因检出率分别为25.0%和27.9%。int1、sul1和qacEΔ1基因均为阳性的菌株检出率为22.1%。在int1、sul1和qacEΔ1基因均为阳性的菌株中,有6株检出携带基因盒,基因盒种类包括blaCTX-M-2-aadA1和blaVIM-60-aadA1-aacA。所有菌株均未检出II和III型整合酶基因。int1和qacEΔ1基因在广西北海市、钦州市和防城港市分离菌株中的检出率差异显著(P0.05,下同);头孢拉定(RAD)的耐药表型与blaCTX-M-2和blaVIM-60基因、新霉素(NEO)的耐药表型与aadA1和aacA基因、磺胺类的耐药表型与sul1基因均无显著相关性。【结论】广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌对氟苯尼考的敏感性最高,可考虑将该抗菌药物作为广西凡纳滨对虾副溶血弧菌病防治的备选药物。副溶血弧菌对大部分抗菌药物的耐药表型与int1基因间未检测到显著相关性、基因盒与相应抗菌药物的耐药表型间相关性也不显著,但I型整合子的流行增加了广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌产生多重耐药的可能性,因此应加强对弧菌整合子—基因盒的监控。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
何秀苗 甘珊珊 熊忠贤 禤金彩 廖艳娟 韦平
研究根据传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列设计了两条引物,通过RT-PCR技术对IBDV的VP2进行扩增,构建IBDV-VP2的标准品质粒,建立基于IBDV-VP2基因的荧光定量RT-PCR检测(QRT-PCR)技术和标准曲线,并检测该QRT-PCR体系的特异性、灵敏度和重复性,最后将该QRT-PCR体系应用于鸡外周血淋巴细胞(PBLs)中IBDV超强毒株(vvIBDV)复制规律以及临床样品的检测。结果表明,建立的QRT-PCR体系特异性好,不能与NDV、IBV及FAV1等发生反应,敏感度为1.51×101拷贝数/μl,扩增效率达1.018,重复性试验组内变异系数和组间变异系数均小于...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李香平 毛芝娟 胡大雁 陈昌福
从2007年3月至6月,在宁波市5个不同的农贸市场共采集贝类样品360份,分离菌株71株,其中5株代表菌株革兰氏染色阴性、弧状、具极生单鞭毛,利用葡萄糖、甘露醇产酸,不利用乳糖、蔗糖,精氨酸双水解酶阴性,VP试验为阴性,赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶为阳性,靛基质、甲基红试验阳性,不产生H2S,初步判断为副溶血弧菌;进一步进行了基于16S rRNA和toxR序列的PCR检测,序列测定结果验证了该5株细菌确实为副溶血弧菌。以16S rRNA序列为基础,分析了分离株与相关细菌菌株的同源性,构建了系统发育树。
[期刊] 水产学报
[作者]
王国良 刘璐 李思源
根据GenBank中蛳鱼诺卡氏菌16S-23S rRNA基因序列设计并合成一对特异性引物,经反应体系优化后建立了检测蛳鱼诺卡氏菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.998;溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰;检测灵敏度可达10 6μg/μL的DNA含量,与嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、麦氏弧菌不发生交叉反应,具有良好的特异性。应用建立的方法在蛳鱼诺卡氏菌病爆发时期,对16份鱼体组织、养殖水体、饲料等样品进行了检测,结果 7份为阳性,与细菌分离、培养检查结果 100%相符。既能检测发病鱼,又能检出未发病且已感...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
拜廷阳 杨增岐 吴志明 普志平 赵明军 闫若潜
【目的】建立猪链球菌9型(SS9)的快速诊断和定量分析方法。【方法】根据GenBank已登录的SS9cps9H基因保守部分序列设计合成引物和TaqMan荧光探针,建立了SS9的TaqMan荧光定量PCR检测方法(Taq-Man FQ-PCR),并进行了敏感性、特异性和重复性试验;利用所建立的检测方法对河南省11例疑似猪链球菌临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了对比。【结果】成功建立了SS9的FQ-PCR检测方法和定量标准曲线,FQ-PCR方法的检测灵敏度可达1.0拷贝/μL,特异性高且重复性良好;利用该方法对11份临床疑似猪链球菌感染组织病料进行的应用检测表明,其中有3份样品为阳性...
[期刊] 水产学报
[作者]
荣小军 廖梅杰 张正 王印庚 刘智超 李彬 王岚 陈贵平
根据克隆得到的迟缓爱德华氏菌gyrB基因序列设计并合成一对特异性引物,通用性和特异性检测结果显示所设计的引物具有良好的种间特异性和种内通用性,构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,经过反应体系优化后建立了检测迟缓爱德华氏菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法线性关系良好,在T m为63℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.32x+39.38,相关系数为0.998,扩增效率为1.00,最低能检测到60个拷贝。应用建立的方法对人工感染的大菱鲆病样进行了检测,3个被检样品均呈阳性反应,证明该方法具有较好的适用性。研究表明,所建立的实...
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