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[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
徐萍 申祥 Fotina Hanna 王三虎 张晓建
为了验证小分子RNA let-7a与其预测靶基因CC趋化因子受体7(CCR7)之间的关系，采用生物信息学软件预测CCR7的3′非编码区(3′UTR)是否存在与let-7a的靶向结合位点；利用PCR扩增出包含靶向结合位点区域的CCR7-3′UTR,并构建其荧光素酶表达载体；将验证后的阳性重组子瞬时共转染人胚胎肾细胞293(293T),进行双荧光素酶报告基因检测；通过将合成的let-7a模拟物和let-7a抑制剂分别转染奶牛乳腺上皮细胞MAC-T,利用qRT-PCR和ELISA检测let-7a与CCR7基因mRNA和蛋白表达水平的变化，验证两者之间的靶向调控关系。菌液PCR和双酶切结果表明，成功构建了重组双荧光素酶报告质粒pMIR-REPORTTM-CCR7-3′UTR。双荧光素酶报告基因检测结果表明，let-7a与CCR7基因之间确实存在靶向调控关系。qRT-PCR和ELISA进一步证实了过表达let-7a能显著下调MAC-T细胞中CCR7基因mRNA和蛋白的表达量(P<0.05),两者存在负调控关系。本研究结果证实了let-7a与CCR7基因之间存在靶向调控关系，为进一步探究其分子机制提供参考。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
顾以韧 梁艳 杨雪梅 陶璇 钟志君 杨跃奎 曾凯 陈晓晖 吕学斌
【目的】为研究miRNAs在仔猪免疫系统发育过程中的调控作用。【方法】本研究采用荧光定量PCR技术(Q-PCR)研究了不同泌乳期(0、3、7、14、21和28 d)的梅山猪和大约克夏猪母乳外泌体中let-7a和let-7f的差异表达。【结果】let-7a和let-7f在泌乳早期(03 d)的表达丰度明显高于泌乳后期(728 d);品种间分析显示梅山猪母乳外泌体中let-7a和let-7f在整个泌乳期(028d)的表达水平均明显高于大约克夏猪。【结论】研究表明,let-7a和let-7f能够正向调控仔猪免疫
关键词：
猪 let-7 母乳 外泌体
[期刊] 中国水产科学
[作者]
赫崇波 木云雷 王志松 周遵春 刘卫东
CC趋化因子(CC Chemokine)是一类能够促进动物体内炎症部位的各种白细胞的补充、激活和黏附的趋化性细胞因子家族,是鱼类天然免疫系统的重要组成部分。趋化因子也是当今国际鱼类分子免疫学研究的热点之一。本研究通过比较基因组学和生物信息学的方法,分析了虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)和斑点叉尾(Ictalurus punctatus)等重要经济鱼类的CC趋化因子基因结构特点和功能,并采用Clustal X的NJ法对所有新的CC趋化因子和先前发表的鱼类趋化因子与其他动物的CC趋化因子进行系统进化分析,建立了3个独特的包含非鱼类...
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
王亚莉 何珂 于静 杨松柏 赵阿勇
网格蛋白介导的胞吞是病毒侵入细胞的重要途径,网格蛋白重链(clathrin heavy chain,CLTC)是形成网格蛋白小窝结构的重要组成部分。针对CLTC基因的转录后调控特别是调控猪Sus scrofa CLTC的miRNA目前还不太清楚。本研究旨在筛选出调控猪CLTC基因的miRNA。利用生物信息学方法预测出6个靶向猪CLTC基因的miRNA,将猪CLTC基因3′UTR克隆至双荧光素酶报告基因载体psi CHECK2中获得双荧光素酶报告基因重组载体psi CHECK2-CLTC-3′UTR。将预测
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
杨琳琳 谢彩霞 龚小玲 鲍宝龙
CC趋化因子是一类能够促进动物体内炎症部位的各种白细胞的补充、激活和黏附的趋化性细胞因子家族,是鱼类天然免疫系统的重要组成部分。分析了从草鱼肠道cDNA文库中筛选到的CC趋化因子基因CCL24,并克隆了阅读框区域内的基因组序列。序列分析表明,CCL24基因由4个外显子和3个内含子组成;外显子拼接的序列与CCL24cDNA序列完全一致,编码95个氨基酸,有2个相邻的半胱氨酸(CC),为典型的CC趋化因子亚家族成员。此外,还发现草鱼CCL24基因存在可变剪接现象,第1内含子没有被剪切掉的非正常转录本翻译后可能产生没有CC趋化因子活性的24个氨基酸的短肽,而且这种转录本在精巢、头肾、皮肤、肝胰脏、肠...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
孟艳青 刘晓飞 刘洋 常亚青 王秀利 姜志强
本实验克隆了大菱鲆趋化因子受体基因CCR3和CCR9的全长cDNA,并进行了鉴定。其中,全长cDNA的克隆采用了5′和3′-RACE。CCR3 cDNA全长1 451 bp,包括92 bp的5′非编码区,276 bp的3′非编码区以及编码360个氨基酸的1 083 bp的开放阅读框。CCR9 cDNA全长1 441 bp,包括59 bp的5′非编码区,278 bp的3′非编码区,以及编码367个氨基酸的1 104 bp的开放阅读框。两种受体均具有7次跨膜结构,符合G蛋白偶联受体的序列特征。系统进化分析表明,大菱鲆CCR3与其他鱼类CCR3聚为一支,大菱鲆CCR9也与其他鱼类的CCR9聚为一支;...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
赵敏蝶 刘杰 赵茹茜
[目的]本文旨在预测和筛选靶向调控鸡糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptor， GR）表达的microRNAs。[方法]用TargetScan、PicTar和miRDB三种软件分别预测靶向鸡GR 3'UTR microRNAs并取交集；构建包含鸡GR 3'UTR的重组质粒及突变质粒，通过双荧光素酶实验鉴定microRNA和鸡GR 3'UTR的靶向性；用TargetScan和miRDB两种软件分别预测候选microRNAs的靶基因，用DAVID软件对预测出的共同靶基因进行GO功能分析；Western blot检测分别过表达候选microRNAs对鸡DF1细胞 GR蛋白表达的影响。[结果]miR124-3p、miR142-3p、miR204/211、miR183、miR18-5p和miR181a/181b是三种软件预测靶向GR 3'UTR的交集microRNA；双荧光素酶实验的结果表明miR142-3p、miR204/211和miR18-5p靶向结合GR 3'UTR；两种软件预测三个候选microRNA的靶基因中都有GR且富集分子功能不同；在DF1细胞中过表达三个候选microRNA后，miR142-3p和miR204/211显著降低GR蛋白水平的表达（P < 0.05）。[结论] miR142-3p、miR204/211和miR18-5p靶向结合鸡GR 3'UTR且miR142-3p和miR204/21可以降低鸡DF1细胞中GR蛋白的表达水平。
关键词：
鸡 糖皮质激素受体 microRNA
[期刊] 中国水产科学
[作者]
施志仪 吴明林 付元帅
let-7是时序发育过程中的重要调控因子,在促进幼体向成体转变过程中起着极其重要的作用。为探讨let-7对牙鲆(Paralichthys olivaceus)从幼体到成体转变的变态发育过程的影响,本实验对let-7进行了克隆与表达研究,并预测了其可能的靶基因。利用普通PCR技术从牙鲆中成功鉴定出let-7及其前体序列,该前体序列在不同的物种间具有高度的保守性。运用实时荧光定量RT-PCR方法分析let-7在牙鲆变态发育不同阶段的表达,结果发现,水温(16±0.5)℃条件下,在牙鲆变态发育的前5个阶段(孵化后17、20、23、29、36 d),let-7的表达量逐渐上升,在变态末期(36 dph...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
吴明林 施志仪 付元帅 张俊玲
MicroRNAs(miRNAs)通过抑制编码基因的转录调控关键的生物学进程。研究发现,let-7是时序发育过程中的重要调控因子,在促进幼体向成体转变的发育过程中起着极其重要的作用。利用Solexa测序技术从牙鲆中成功鉴定出let-7家族的10个成员((let-7a,let-7b,let-7c,let-7d,let-7e,let-7f,let-7g,let-7h,let-7i,let-7j)。相对于let-7家族其他成员,let-7d的拷贝数最多,推测其在牙鲆发育过程中扮演着更重要的角色。运用实时荧光定量PCR方法分析let-7d在牙鲆变态发育不同时期的表达,结果发现,在对照组和甲状腺激素处理...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
季文瑶 付元帅 施志仪 谢燕
牙鲆(Paralichthysolivaceus)是研究鱼类变态发育的理想模型,其右眼移位及生活习性的改变受甲状腺激素(TH)调控。同时microRNA (miRNAs)在变态期间发挥关键性作用。为研究TH、pol-miR-124及Otx2在牙鲆变态中的调控机制,本实验通过生物信息学方法预测pol-miR-124潜在靶基因Otx2,首先利用qRT-PCR检测在牙鲆各组织、正常变态及外源TH处理仔鱼后pol-miR-124和Otx2的表达模式。然后克隆400bp含有"种子序列"的Otx23′UTR区序列,构建野生型重组载体pmirGLO-Otx2并转染293T细胞检测双荧光素酶活性确定靶向关系。qRT-PCR结果表明:pol-miR-124和Otx2均在脑和眼睛组织中特异性高表达;在仔鱼变态28 dph表达量最高与变态进程相一致; TH作用下,在20 dph、24 dph时期, pol-miR-124的表达量低于正常组,而Otx2的表达量高于正常组;在28 dph、32dph、36dph时期,pol-miR-124的表达量高于正常组,但Otx2的表达量低于正常组,两者呈现出相反的表达趋势;双荧光素酶结果显示pol-miR-124靶向负调控Otx2。本实验旨为揭示牙鲆视觉感光系统的发育机制奠定研究基础,同时为探讨牙鲆变态发育机制提供了新的理论依据。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王星果 邵芳 龚道清 卢祥云 顾志良
【目的】研究miR-133a在鸡不同组织中的表达情况,对baculoviral IAP repeat containing 5(BIRC5)进行靶基因的试验验证,探讨鸡miR-133a对BIRC5的靶向调控作用。【方法】采用生物信息学方法对miR-133a靶基因进行预测,并用双荧光素酶报告系统及点突变试验对BIRC5进行靶基因验证,同时运用实时荧光定量PCR检测miR-133a在鸡不同组织中的表达量。【结果】在鸡3′UTR数据库的11 891个基因中预测到287个miR-133a的靶基因;miR-133a在鸡的组织表达谱中显示其在肌肉中的表达量较高,尤其是在骨骼肌中表达量最高;报告基因试验显示...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
鲍宝龙 李家乐 汪桂玲 刘占江
通过探针杂交筛选斑点叉尾(Ictalurus punctatus)BAC基因组文库,利用引物步移的方法对阳性克隆BAC047 K12进行序列测定,得到2 815 bp的SCYA126基因组序列。序列分析表明,SCYA126基因由2个外显子和1个内含子组成;外显子拼接的序列与SCYA126cDNA序列完全一致,编码92个氨基酸,在N端含有2个相邻的半胱氨酸(CC)和2个不相邻的半胱氨酸,为典型的CC趋化因子亚家族成员;其上游调控序列包含TATA框启动子序列和一些与免疫相关的转录因子结合位点。另外,根据与GenBank接收号为BM029630的EST序列的比较分析,发现SCYA126基因组中的内...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张永珍 陈松林 王磊
趋化因子是一类具有化学趋化功能的小分子分泌性蛋白,能够引导白细胞到损伤或者感染的部位,参与免疫调节和病理反应。为丰富鲆鲽鱼类趋化因子的相关基础研究,本研究克隆了牙鲆(Paralichthys olivaceus)趋化因子基因CXCL9,其全长为910 bp,开放阅读框为408 bp,编码135个氨基酸。该基因具有趋化因子超家族的典型特征,在35、37、60和77个氨基酸位置具有4个保守的半胱氨酸残基,形成两个二硫键。氨基酸序列分析表明,该基因与大菱鲆(Scophthalmus maximus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的CXCL9基因具有较高的同源性,分别为78.5%和71.0%。实时荧光定量PCR结果显示, CXCL9在正常牙鲆肝脏和脾脏中的表达量非常高,在皮肤和鳃等组织中表达量次之,说明CXCL9特异性地在免疫相关组织中表达。经迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA表达量在感染后6 h即出现高峰值,而头肾和脾脏中的高峰值出现较晚。经鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后6 h,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA的表达量升高近8倍,头肾中的表达高峰值出现在感染后24 h,而脾脏中CXCL9 mRNA的表达量在感染后6 h迅速升高10倍,逐渐降低后48 h又出现高峰,为正常水平的20倍。上述研究结果说明CXCL9基因在病原菌感染过程中有快速响应,可能参与了免疫防御过程,将有可能发展为一种牙鲆细菌性疾病的生物标记。本研究为牙鲆趋化因子超家族免疫机制的深入研究奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
冶贵生 张彦明 徐浩 郭抗抗
利用RNA干扰在线生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列(其结构特征为正链(19nt)-环(9nt)-负链(19nt))。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体中,构建重组载体pGene-NS3-1,pGene-NS3-2和pGene-NS3-3,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对转化产物进行kan+筛选,碱裂解法提取重组质粒,将酶切鉴定为阳性的质粒测序。结果显示,双链干扰片段克隆方向正确,序列中未出现核苷酸的插入,缺失等突变现象。表明靶向猪瘟病毒NS3基因shR...
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵恒 张宏 廖芳丽 李刚 赵福永
基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术是一种新兴的分子修饰工具,可实现基因组特定位点碱基的缺失、插入或替换,造成基因功能丧失,现已广泛应用于基因功能的研究。为深入探讨甘蓝型油菜中Bn SVP的生物学功能,以中双11号基因组(甘蓝型油菜参考基因组,v4.1)中的4个Bn SVP为靶标基因,并针对不同染色体上的Bn SVP基因,应用CRISPR-P 2.0软件共设计了12条特异sg RNA种子序列,以实现4个Bn SVP同源基因的全部或部分敲除;以p YLCRISPR-Cas9P35S-H为基本载体,以At U3b或At U3d为sg RNA转录启动子,采用Golden gate cloning技术分别组装构建了6个双靶点CRISPR/Cas9植物表达载体。测序结果表明,6个CRISPR/Cas9植物表达载体各sg RNA表达盒DNA序列正确,双靶点组装顺序无误。研究结果为进一步原生质体瞬时表达和农杆菌介导的油菜遗传转化奠定了基础,同时也为应用CRISPR/Cas9基因组编辑系统研究植物多拷贝同源基因的功能提供参考。
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