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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
翟留涛 秦魏 刘娜女 奚绪光
【目的】通过大肠杆菌表达纯化牛(Bos taurus)RECQL蛋白,利用停流光谱技术对解旋条件进行优化,为研究RECQL的酶促反应动力过程奠定基础。【方法】将人工合成的牛RECQL蛋白编码序列与pET21a载体相连接,获得重组表达载体pET21a-BtRecql后,将其导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达,经过Ni-NTA亲和层析和Superdex 200凝胶过滤层析,得到纯化的重组蛋白BtRECQL;再利用停流光谱技术对BtRECQL解旋过程进行检测分析,通过摸索不同的试验参数找到BtRE
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭海磊 刘娜女 段晓雷 奚绪光
【目的】通过原核表达系统获得嗜热的厌氧棒菌(Anaerobaculum hydrogeniformans)DNA解旋酶Pif1(AnaPif1),研究其体外最佳解旋条件,为深入研究嗜热菌Pif1家族解旋酶工作机理提供参考。【方法】构建重组载体pET15b-sumo-AnaPif1,将重组载体转入表达菌株BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA柱和Heparin柱纯化最终获得全长AnaPif1蛋白;利用停流-荧光共振能量转移(FRET)技术,以pH值和Tris-HCl、NaCl、MgCl_2浓度
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李康 郭海磊 奚绪光
【目的】探索牛和果蝇DHX36解旋酶的表达纯化条件及底物结合活性,为深入研究DEAH-box解旋酶提供理论参考。【方法】以较高等动物牛(Bos taurus)和较低等动物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)RNA解旋酶BtDHX36和DmDHX36为研究对象,首先,构建重组表达载体pET15b-sumo-BtDHX36和pET15b-sumo-DmDHX36,将2种质粒分别转入表达菌株BL21(DE3)中,诱导表达2种目的蛋白,利用Ni-NTA层析柱、HisTrap SP HP柱纯化得到目的蛋白。然后,采用荧光各向异性法(FA)研究溶液和温度条件对2种蛋白底物结合活性的影响,以及二者的底物结合偏好性。最后利用快速停流-荧光共振能量转移(FRET)技术对2种DHX36的双链底物解旋活性进行比较。【结果】获得了纯度大于95%的全长BtDHX36和DmDHX36蛋白,2种DHX36解旋酶的最佳底物结合条件为:20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)、50 mmol/L NaCl、2 mmol/L MgCl_2、反应温度37℃。在此条件下,2种同源DHX36均可结合多种类型核酸底物(ssRNA、ssDNA、parallel G4、anti-parallel G4),且BtDHX36结合平行结构G4底物(parallel G4)的倾向更明显,DmDHX36无此趋势;2种DHX36解旋酶结合不同长度ssDNA的能力不同,BtDHX36更倾向于结合较长的单链DNA底物,而DmDHX36更倾向于结合较短的单链DNA底物;二者均能高效解旋dsRNA和dsDNA底物,DmDHX36更倾向于解旋dsDNA,而BtDHX36无明显倾向性。【结论】成功表达并纯化了BtDHX36和DmDHX36蛋白,确定了其最适结合条件,比较了2种DHX36解旋酶对不同底物的结合及解旋偏好。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张磊 唐永凯 李红霞 徐逾鑫 李迎宾 俞菊华
为获得可溶的鲤鱼IL–17N重组蛋白,构建原核重组表达质粒GST–17N、SUMO–GST–17N和MBP–17N,确定IL–17N的最适促溶标签,并优化其诱导表达条件(诱导剂异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)的浓度、诱导时间和诱导温度)。结果:成功构建了鲤鱼IL–17N原核重组表达载体GST–17N、SUMO–GST–17N和MBP–17N;融合标签MBP、SUMO–GST和GST的促溶效果依次降低,SUMO–GST–17N、MBP–17N上清蛋白占总蛋白比例分别为47.4%、87.0%;MBP–17N的最佳表达条件为0.5 mmol/L IPTG,25℃诱导8～12 h;经过镍柱纯化,获得可溶MBP–17N蛋白,每克总菌约获得0.09 mg MBP–17N蛋白。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王帅锋 刘娜女 段晓磊 罗亦欣 范三红 奚绪光
【目的】通过原核表达系统获得热脱硫弧菌（Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓＴｏｎｉｉ ｈ．）Ｐｉｆ１解旋酶（ＴｙＰｉｆ１），研究ＴｙＰｉｆ１解旋酶的嗜热特性和解旋机理。【方法】将ＴｙＰｉｆ１解旋酶编码区和ｓｕｍｏ促溶标签编码区融合连入ＰｅＴ１５ｂ获得重组表达载体ＰｅＴ１５ｂ－ｓｕｍｏ－ＴｙＰｉｆ１，将该重组载体导入大肠杆菌ｂｌ２１（ｄｅ３）菌株诱导表达，经ｎｉ－ｎＴＡ柱亲和纯化获得融合蛋白，ｓｕｍｏ蛋白酶切除标签，再经ｎｉ－ｎＴＡ柱去除标签蛋白及ｓｕｍｏ蛋白酶，经ｈｅＰＡｒｉｎ柱进一步纯化最终获得ＴｙＰｉｆ１全长蛋白。通过荧光各向异性、圆二色谱（Ｃｄ）和荧光共振能量转移（ｆ．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
文征宇 侯文韬 杨龙雨 陈鹏
【目的】建立牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ(Vaccinia topoisomeraseⅠ)的原核表达体系及纯化方法,以获得高活性、高纯度的牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ。【方法】优化并人工合成牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ的全基因序列,构建牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ的原核表达载体(pET28a/TOPO)并转化E.coliBL21 Star(DE3)菌株,优化其诱导表达条件,表达蛋白经Talon his-tag purification resin螯合层析柱纯化,用SDS-PAGE鉴定纯化效果,借助酶切质粒pLLP-OmpA检测纯化蛋白的活性。【结果】转化pET28a/TOPO的E.coliBL21 Star(DE3)特异地表...
关键词：
牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ 原核表达 蛋白纯化
[期刊] 西南农业学报
[作者]
石照应 曲月秀 陈蓉 田兴贵
为进一步研究MSTN重组蛋白的表达及相关功能奠定基础,利用RT-PCR克隆贵州黑山羊MSTN基因cDNA序列,构建原核表达载体pET-32a(+)-MSTN69,并对重组菌表达条件进行优化和Ni亲和层析纯化His-MSTN69蛋白。结果表明:表达产物与预期大小相符,His-MSTN69蛋白分子量为57.8 kD;在温度31℃和IPTG 0.8 mmol/L的条件下表达5h时,BL21-pET-32a(+)-MSTN69重组菌蛋白表达量最高。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李波 倪志勇 范玲
为了深入研究GhCOMT3基因的功能,将GhCOMT3基因构建到原核表达载体pET-28a中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。用0.2mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,结果发现,16℃诱导12h、30℃诱导3h和37℃诱导3h后融合蛋白均以包涵体的形式表达;30℃诱导的蛋白表达量最大,之后对包涵体进行变性溶解,进行SDS-PAGE检测,再经过蛋白标记亲和层析柱(His TrapTMHP)纯化得到变性的pET-28a-GhCOMT3融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化效果,鉴定表达产物,目的蛋白相对分子量约为39.119kDa,检测结果与预期一致。结...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孟星宇 李婷 李沐 刘宁 田玉华 胡薇
【目的】克隆梅花鹿(Cervus nippon)胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)的成熟肽基因,并对其进行原核表达及纯化,以获得具有生物学活性的蛋白,为研究IGF-1在梅花鹿鹿茸生长发育中的调控作用及机理提供参考。【方法】以GenBank中的梅花鹿IGF-1基因序列(登录号:HQ890468)设计1对引物,以构建的梅花鹿pMD-18T-IGF-1重组质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽的基因序列,构建重组质粒pMD-IGF-1,将其插入pET-32a表达载体后,构建pET-32a-IGF-1质粒,鉴定后,将pET-32a-IGF-1转入Ros...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张伟 李翠萍 杨志军 何广杰
采集红鳍东方鲀脂肪组织提取其总ＲＮＡ，采用ＲＴ–ＰＣＲ方法扩增和克隆红鳍东方鲀Ｆｏｘｏ１基因的ｏＲＦ，并构建其原核表达载体Ｐ ＥＴ–３２／Ｆｏｘｏ１，在大肠杆菌ＲｏｓＥＴＴＡ（ＤＥ３）进行表达，通过ＩＰＴＧ诱导表达，对重组Ｆｏｘｏ１蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定，结果表明：重组质粒Ｐ ＥＴ３２Ａ／Ｆｏｘｏ１被成功构建；用ＩＰＴＧ进行诱导表达，融合蛋白主要以可溶蛋白形式存在，能与抗ＨＩｓ标签的兔多克隆抗体发生特异性反应；纯化出了融合表达蛋白，获得了相对分子质量约为１１０ ０００的重组蛋白。
[期刊] 华北农学报
[作者]
谢玮怡 毕燕会 周志刚
为研究海带核基因组编码的nuc Cbb X蛋白的结构和功能,根据海带配子体核基因cbb X(Gen Bank登录号:NP_053838)设计含有酶切位点的引物,通过RT-PCR方法获得末端连接NdeⅠ、XhoⅠ酶切位点的完整ORF。序列保守性分析表明,预测的海带成熟nuc Cbb X蛋白序列含具有AAA+结构域、Walker-A和Walker-B ATP结合位点及ATP水解酶和Ru Bis Co活化酶活性相关位点。序列相似度分析表明,海带nuc Cbb X与其质体基因组编码的pt Cbb X和类球红细菌的Rs Cbb X蛋白氨基酸序列相似度均较低,分别为37.4%和36.8%,相比pt Cbb...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵正阳 刘娜女 李海红 奚绪光 范三红
【目的】利用大肠杆菌表达纯化嗜热脱铁去硫弧菌（Deferribacter desulfuricans）解旋酶DePif1，并对其结合与解旋DNA的活性进行分析，为Pif1家族解旋酶结构和功能的阐明奠定基础。【方法】将促溶标签SUMO编码序列和人工合成的DePif1解旋酶编码序列依次连入pET15b载体，获得重组融合表达载体pET15bSUMODePif1，然后将其导入E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达；利用NiNTA亲和层析柱获得融合蛋白，SUMO蛋白酶酶切去除融合标签，再经Heparin和NiNTA柱分离获得无标签的纯化重组DePif1蛋白；采用荧光各向异性分析，研究pH和Na...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
谭永安 肖留斌 孙洋 赵静 柏立新
【目的】克隆绿盲蝽超气门蛋白基因(ALUSP),获得原核表达的重组蛋白,为ALUSP的功能研究奠定基础,也为进一步解析绿盲蝽蜕皮及变态发育的机制提供理论依据。【方法】根据已知昆虫的USP基因序列设计简并引物,获得ALUSP的保守序列;再通过设计特异性引物,利用RACE方法,分别克隆ALUSP 5′及3′段序列,然后通过拼接获得ALUSP全长序列;应用生物信息学方法,对ALUSP基因序列特征及其所编码蛋白的特性进行分析,建立系统进化树;将含有ALUSP的T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建ALUSP原核表达载体pEGX6P1-ALUSP,将该表达载体分别在15、25、30和37℃条件下进...
关键词：
绿盲蝽 超气门蛋白 基因克隆 原核表达
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
周佳平 林新春 徐英武
SEPALLATA3(SEP3)属于花器官建成ABCE模型中的E类基因,为了揭示SEP3蛋白是如何形成多聚体的,以及多聚体与其生物学功能之间的联系,开展了拟南芥Arabidopsis thaliana AtSEP3蛋白质体外可溶性表达实验,构建了原核表达载体,并在大肠埃希菌Escherichia coli细胞中进行重组蛋白的诱导表达。从蛋白不同的结构域、诱导时间和诱导温度等方面对蛋白的可溶性表达进行了分析。最后以pET-15b为表达载体,大肠埃希菌表达菌株E.coli‘Rosetta’为宿主菌株,22℃诱导表达15 h,获得不同片段的AtSEP3可溶性蛋白。通过镍柱及分子层析色谱柱分离纯化,表...
[期刊] 海洋渔业
[作者]
朱欣云 丁少青 张哲 任建峰 濮家飞 贾亮 李伟明 张庆华
海七鳃鳗(Petromyzon marinus)是现存最古老的无颌类脊椎动物之一,对其重要免疫分子的研究在免疫系统的进化理论上有重要意义。细胞趋化因子CXCL8(又称白细胞介素-8,Interleukin 8)是最重要的趋化因子之一。为了研究海七鳃鳗CXCL8基因在天然免疫中的作用,以海七鳃鳗肝脏c DNA为模板,通过比对海七鳃鳗基因组信息设计引物,使用RT-PCR方法扩增得到PmCXCL8基因。随后构建原核表达载体pColdI-CXCL8,将载体转化至E.coli BL21和Rosetta(DE3)中进
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