【目的】克隆牛EGR2基因转录本X1（EGR2-X1）的CDS区，检测其在不同组织和前体脂肪细胞分化过程中的表达模式并预测其编码蛋白的结构与功能。【方法】采用PCR结合测序技术扩增牛EGR2-X1的CDS区，胶原酶消化法分离牛前体脂肪细胞，利用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR， RT-qPCR)检测EGR2-X1在牛的心、肝、脾、肺、肾、肌肉和背部脂肪组织中的表达规律及前体脂肪细胞分化过程中的时序表达模式，同时利用ProtParam、Phyre2、NetPhos 3.1等软件分析EGR2-X1的理化性质与蛋白结构。【结果】成功克隆牛EGR2-X1的CDS区，其CDS区全长1458 bp，编码一条由485个氨基酸构成的不稳定且不存在跨膜结构与信号肽的亲水性蛋白，该蛋白含有3个典型的锌指结构域，其氨基酸主要由无规卷曲和延伸链构成，主要在细胞核内发挥作用，同时，蛋白互作网络预测发现，EGR2-X1可能与SOX10、EGR1、EGR3等蛋白存在互作关系。系统进化树分析发现普通牛与水牛亲缘关系最近，与斑马鱼亲缘关系最远，表明EGR2-X1蛋白在物种间保守性较强。组织表达谱分析显示，EGR2-X1在心、肝、脾、肺、肾、肌肉和背部脂肪组织中均有表达，在肺脏中表达量最高，背部脂肪和肝脏中表达量次之，肾脏中表达量最少。细胞时序表达谱表明，EGR2-X1在第3天表达量最高，此后逐渐下降，至第7天表达量最低。【结论】EGR2-X1在调控牛脂肪细胞的增殖分化和脂质代谢过程中发挥重要功能。

为明确秦川牛CDS1基因的编码序列、分子特征及其在不同组织的表达特点，以秦川牛为研究对象，利用PCR扩增技术克隆CDS1基因的全编码区序列，利用生物信息学方法分析其全编码区的序列特征，以GAPDH为内参基因，采用qRT-PCR技术检测CDS1基因在脑、睾丸、胰、肺、脾、肾、瘤胃、背最长肌、肝、肌内脂肪和心组织中的表达水平。结果显示，秦川牛CDS1基因编码区为1 392 bp,编码464个氨基酸，CDS1基因在不同物种间具有较高的保守性，且与瘤牛的同源性最高；CDS1基因编码蛋白为疏水性不稳定跨膜蛋白，主要由α-螺旋及不规则卷曲构成；亚细胞定位分析表明，CDS1蛋白主要分布于内质网和线粒体；蛋白互作分析表明，其与PGS1、PPAPDC1系列、CDIPT、PLD系列、CRLS1等与磷脂合成相关的核糖蛋白存在相互作用，提示CDS1基因参与调节磷脂的合成代谢过程；组织表达分析表明，CDS1基因在各个组织均有广泛表达，且在睾丸中表达量最高，在脑的表达水平也较高，二者均显著高于其他组织的表达水平，在心的表达量最低。

旨在克隆延边牛UCP1(Uncoupling protein-1)CDS区序列,利用RT-PCR技术和基因克隆获得延边牛UCP1基因,与其他物种进行同源性比对及构建系统进化树,利用生物信息学方法预测UCP1编码蛋白质的理化性质、潜在的磷酸化位点等性质,利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)方法检测UCP1基因在延边牛不同组织的表达丰度。结果显示,延边牛UCP1基因的CDS区全长749 bp,编码249个氨基酸。同源性比对发现延边牛UCP1基因与印度牛同源性为99.47%,系统进化树表明,延边牛与印度牛的亲缘关系最近和南美羊驼亲缘关系最远。UCP1蛋白缺乏稳定性,脂溶系数是91.53,网状红细胞于体外的半衰期是30 h,总平均亲水性等于0.212,预测其具一定亲水性。二级结构由α-螺旋(54.03%)、延伸链(12.90%)、无规卷曲(27.42%)和β-转角(5.65%)所构成的混合型蛋白。磷酸化位点和糖基化位点分析结果表明,UCP1共有21个磷酸位点,4个潜在的O-糖基化位点,3个N-糖基化潜在位点。UCP1基因的编码产物无跨膜螺旋(TMHs)结构,跨膜螺旋氨基酸残基数量的预测值19.008 57,蛋白质前60个氨基酸的跨膜螺旋数预测值为10.980 09,位于膜细胞质侧的总概率22.995%且属于非分泌蛋白。经实时荧光定量PCR(RT-PCR)可知,延边牛脂肪与小肠内UCP1基因表达水平相对较高,而在肌肉、心脏中的表达水平较低。该试验结果可为进一步研究该基因的功能提供借鉴。

为了揭示三七抗病防卫反应的调控机制,对三七的一个NAC转录因子的全长cDNA进行了克隆和表达特性分析。以一年生三七幼苗为材料,根据编码NAC转录因子的三七转录组Unigene设计引物,采用快速扩增cDNA末端技术,克隆得到一个新的NAC转录因子基因,命名为PnNAC1。序列分析表明,该基因全长815 bp,含有24 bp的5'非翻译区和215 bp的3'非翻译区,以及576 bp开放阅读框,共编码191个氨基酸,具有保守的NAC结构域。实时荧光定量PCR结果显示茉莉酸甲酯预处理三七根部大幅提高了PnNAC

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式，以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材，利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位，克隆到HvnANT1基因，对其进行生物信息学分析。结果表明：1）在7H染色体的84.30—86.00cM获得1个MYB类转录因子，命名为HvnANT1。2）该基因长1 033bp，其完整开放阅读框为762bp，编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14kU，是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构，无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成，具有2个SANT结构域（分别位于第13—第63个；第66—第114个氨基酸）。3）同源比对与系统进化分析表明：青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%；这些序列都具有2个高度保守的2个SANT结构域；与大麦的亲缘关系最近，其次是与乌拉尔图小麦，与水稻最远。4）亚细胞定位结果表明，该基因定位在细胞核内。5）实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示：与籽粒颜色形成的乳熟早期和乳熟晚期相比，软面团期的HvnANT1基因在‘涅如姆扎’中表达量极显著上调，而在‘昆仑10号’中各时期的表达量较低且差异不显著；且软面团期的‘涅如姆扎’籽粒HvnANT1基因的表达量极显著高于‘昆仑10号’（P<0.01）。花青素合成相关的结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR与该基因表达量模式相似。综上，青稞HvnANT1蛋白结构中的SANT结构域在物种进化过程中比较保守；该基因定位在细胞核内，符合转录因子特性；HvnANT1基因表达模式与结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR相似，在籽粒颜色形成的软面团期表达量极显著升高。

【目的】研究奶牛干扰素调节因子5（Interferonregulatoryfactor5，IRF5）基因在奶牛乳腺组织及乳腺上皮细胞炎症中的表达模式。【方法】利用RT-PCR和测序技术克隆得到IRF5基因的编码区（Codingsequence，CDS）序列，并采用生物信息学方法分析IRF5基因及其特性；利用qPCR技术检测IRF5基因及相关干扰素调节因子3（Interferonregulatoryfactor3，IRF3）和MyD88基因的表达量。【结果】IRF5基因的CDS长度为1500 bp，编码499个氨基酸，存在47个潜在磷酸化位点，氨基酸组成中脯氨酸（Pro）和亮氨酸（Leu）所占的比例较高。IRF5蛋白分子式为C_(2524)H_(3901)N_(671)O_(728)S_(20)，主要存在于细胞核和线粒体，理论等电点为5.38，是碱性亲水且不稳定的非分泌蛋白。蛋白互作分析结果显示，IRF5蛋白可能与骨髓分化初级反应蛋白（MyD88）、白细胞介素-1受体相关激酶1（IRAK1）、C-C基序趋化因子4（CCL4）、组蛋白乙酰转移酶p300（EP300）和核受体共激活因子3异构体X1（NCOA3）等蛋白相互作用，与机体或细胞的炎症反应有关。qPCR结果表明，与健康奶牛相比，IRF5基因在乳房炎奶牛的乳腺组织中的表达量极显著上调（P < 0.01）。在乳腺上皮细胞中，与对照组（0 h）相比，IRF5及其相关的Myd88和IRF3基因在LPS诱导乳腺上皮细胞炎症反应的3、6和12 h的表达量均极显著上调（P < 0.01）。【结论】IRF5基因在奶牛乳房炎过程中表达量上调，可能通过上述基因参与促进奶牛乳房炎症反应。

【目的】研究陕南地区桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶基因,为构建高效分解纤维素的工程菌奠定基础。【方法】用质量分数为1%的羟甲基纤维素钠(CMC-Na)测定桑天牛幼虫内切β-1,4-葡聚糖酶活性,Trizol法提取桑天牛肠道总mRNA,扩增其内切β-1,4-葡聚糖酶基因,用DNAStar和NCBI上的BLAST进行序列分析。根据测序得到的基因序列设计1对引物,扩增桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶基因CDs区,构建原核表达载体pET-APEG,并在大肠杆菌中表达。【结果】桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶最适pH为4.4~5.6,pH值为5.0时酶活性最高;最适温度为30~50℃,50℃时酶活最高;酶液...

【目的】研究奶山羊硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(stearoyl-CoA desaturase,SCD)在乳腺上皮细胞中对不饱和脂肪酸合成过程相关基因的调控及对细胞脂肪酸组成的影响。【方法】用RT-PCR方法从西农萨能羊乳腺组织中扩增SCD基因,进行序列分析和组织表达谱分析;构建重组腺病毒质粒,进行包装和扩增后,感染体外培养的奶山羊原代乳腺上皮细胞,实时定量检测相关基因的表达,western blotting检测蛋白变化,气相色谱-质谱联用分析细胞内脂肪酸组成变化。【结果】①获得了全长1 080 bp的山羊乳腺SCD基因CDS(GenBank登录号:GU947654)并对其进行了生物信息学分析;②...

旨在探究DNA损伤诱导转录本3(DDIT3)基因序列特征及其在母牦牛组织表达特性。以母牦牛为研究对象,利用RT-PCR技术克隆牦牛DDIT3基因,利用生物信息学软件分析DDIT3蛋白的结构和功能,并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测DDIT3基因在牦牛不同组织及不同生理阶段的生殖器官和卵母细胞中的表达特征。结果显示:牦牛DDIT3基因CDS区全长507 bp,共编码168个氨基酸;核苷酸序列比对发现,牦牛与野牛同源性最高,为99.71%,与其他物种的同源性均在88%以上,说明DDIT3基因在进化过程中表现出高度保守性;牦牛DDIT3基因在卵巢中的表达量极显著高于心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺、子宫和输卵管(P<0.01);在卵巢中,妊娠期DDIT3基因的表达水平显著高于卵泡期、黄体期和胎儿期(P<0.05),黄体期的表达量显著高于胎牛期(P<0.05);在子宫中,妊娠期DDIT3基因的表达水平显著高于卵泡期和胎牛期(P<0.05);DDIT3在各时期输卵管中表达水平差异不显著;MⅡ期卵母细胞中DDIT3基因的表达水平显著高于GV期和MⅠ期(P<0.05),MⅡ颗粒细胞DDIT3基因的表达量也显著高于GV期和MⅠ期(P<0.05),GV期、MⅠ期的卵母细胞和颗粒细胞DDIT3表达量差异不显著。综上,牦牛DDIT3基因可能在维持母牦牛卵巢机能与妊娠以及卵泡发育与成熟过程中发挥重要的调控作用。

为研究芍药PlSPL1(SPL)基因的性质和功能，进一步阐明PlSPL1基因在不同物种中的共性与特征差异，探明PlSPL1在芍药茎秆挺直程度中的作用。以芍药红峰茎秆为材料，采用RACE技术获得了芍药PlSPL1基因全长序列，利用生物信息学软件分析预测PlSPL1的结构、理化性质和亲缘关系，随后利用qRT-PCR技术分析PlSPL1在芍药茎秆不同发育时期的表达量，并通过激光共聚焦扫描显微技术进行了蛋白质亚细胞定位分析。结果表明：PlSPL1基因开放阅读框为3 000 bp,编码999个氨基酸。蛋白分子式为C_(4869)H_(7682)N_(1406)O_(1497)S_(43),分子量为111.25 ku,理论等电点为6.26,编码亲水性不稳定酸性蛋白，磷酸化修饰以丝氨酸为主，无信号肽，有跨膜结构，二级结构主要由无规则卷曲组成。系统进化树分析发现，PlSPL1蛋白与牡丹的亲缘关系最近，其次和葡萄有较近的亲缘关系；蛋白序列比对分析发现，PlSPL1蛋白具有SPL转录因子家族特有的SBP保守结构域。相对表达量分析发现，PlSPL1随着茎秆发育逐渐呈现下降趋势，表明PlSPL1负向调控芍药茎秆发育，推测其可能在茎秆挺直程度方面起重要作用；亚细胞定位显示，PlSPL1蛋白定位在细胞核中。上述结果表明，PlSPL1参与芍药茎秆发育过程。

【目的】通过克隆白桦BpTCP2基因,分析其序列特征,并检测该基因在不同组织部位、激素处理及非生物胁迫下的基因表达特性,为揭示BpTCP2在植物生长发育及逆境应答中的作用提供理论依据。【方法】通过PCR技术克隆BpTCP2基因的全长,并对得到的cDNA序列进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR技术分析该基因的组织表达特性,以及在外源植物激素(ABA、IAA、BR、JA、SA)处理和非生物胁迫(CdCl_2、NaCl、NaHCO_3、PEG)下的响应模式。【结果】成功克隆了BpTCP2基因的cDNA序列;生物信息学分析发现BpTCP2含有高度保守的bHLH结构域,属于PCF亚类。qRT-PCR结果显示,BpTCP2基因在木质部、幼嫩的叶片和茎节中表达量较高;在CdCl_2、NaCl、NaHCO_3处理下,该基因持续上调表达;且5种外源激素均能诱导该基因表达。【结论】BpTCP2基因参与白桦木质部的形成,影响叶片及初期茎节的发育,并能在各激素、重金属、盐、碱的诱导下表达。

为探明大豆中HKT蛋白基因的耐盐作用机理,从耐盐大豆材料中克隆到GmHKT6;2基因完整的cDNA序列,GmHKT6;2基因的开放阅读框(ORF)全长1 644 bp,编码547个氨基酸。序列比对与进化树分析表明:GmHKT6;2是大豆中的一个新HKT蛋白基因;GmHKT6;2基因在大豆的根、茎及叶中均能表达,150 mmol/L NaCl处理后,该基因在大豆根、茎及叶中的表达被强烈诱导并高效表达。结构域分析结果表明:大豆GmHKT6;2基因拥有10个可能的跨膜结构域(TMD)和阳离子转运蛋白保守结构域,推测其是通过调节相关阳离子的转运来调控大豆的耐盐性。

植物在受到高温、低温、干旱和盐害等逆境胁迫时,ERF作为信号转导因子被诱导并调控其他抗逆基因的表达。研究茶树AP2/ERF-B3类转录因子在不同茶树品种间的分子特性、组织表达和逆境响应情况,将有助于了解AP2/ERF转录因子在茶树逆境调控中的作用。以2个茶树品种‘安吉白茶’和‘迎霜’为试验材料,通过RT-PCR方法分别从2种茶树的cDNA中克隆得到CsERF-B3基因。利用实时定量PCR技术检测该基因在茶树根、茎、叶、花各组织和4种非生物逆境胁迫处理(4℃低温、38℃高温、200 g·L-1PEG干旱处理、200 mmol·L-1NaCl)中的表达情况。结果表明:2种茶树中CsERF-B3基因...

【目的】克隆山葡萄(Vitis amurensis)CBF1转录因子基因(VaCBF1),为其功能的深入研究及其在植物抗寒基因工程中的应用奠定基础。【方法】根据植物CBF基因AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,利用PCR法从山葡萄cDNA中扩增VaCBF1基因的中间片段。再根据中间片段区域设计2对特异引物,采用反向PCR法扩增VaCBF1基因的5′端和3′端序列。将中间片段与5′端和3′端序列拼接后得到山葡萄VaCBF1基因的cDNA全长序列,据此设计1对特异引物,PCR扩增VaCBF1基因编码区的全长序列,并对其进行生物信息学分析。同时,利用荧光定量PCR分析山葡萄VaCBF1基因在不...

【目的】克隆苎麻转录因子基因BnbZIP1,分析其序列及表达特征,同时进行原核表达以及亚细胞定位分析。【方法】根据苎麻转录组测序中的Unigene48047片段序列,采用RT-PCR结合RACE技术克隆该基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用Real-time PCR分析该基因在不同组织和不同胁迫条件下表达特征;构建原核表达载体,进行原核表达;构建含EGFP的融合表达载体,观察其亚细胞定位情况。【结果】苎麻BnbZIP1的cDNA全长为2 071 bp,开放读码框为1 407 bp,编码468个氨基酸,推导该多肽的等电点和分子量为7.12和51.57kD,与毛果杨(XP_00230...