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[期刊] 草业科学
[作者]
马春娟 杨宇泽 邹爱爱 孙康永杰 万雪瑞 王川 魏亚琴
为提高纤维素的降解效率、构建高效表达的纤维素酶基因工程菌，本研究以牛瘤胃液微生物全基因组为模板，首先通过PCR扩增内切葡聚糖酶eg基因，然后与pET-28a连接获得表达载体pET-28a::eg并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21(DE3)中，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达EG蛋白，最后用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定重组内切酶的酶活力，分析其酶学性质。结果表明：成功构建表达载体pET-28a::eg，重组菌株E. coli BL21/pET-28a::eg在28℃用IPTG诱导14 h后纯化得到重组的EG蛋白，EG蛋白大小约为50 kDa，刚果红染色有明显水解圈。用DNS法测得EG的酶活为12.60 U·mL~(-1)，滤纸总酶活为3.53 U·mL~(-1)。重组酶在不同底物的反应中，羧甲基纤维素钠为底物的酶活力最高，脱脂棉最低。重组酶的最适温度为40℃，最适pH为7.0。在此条件下，Ca~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)、K~+、Mn~(2+)等离子均可对重组蛋白EG的酶活力具有促进作用，Zn~(2+)可促进但差异不显著，而Hg~(2+)、Cu~(2+)对EG的酶活力具有抑制作用。本研究构建的重组内切酶菌株可以高效水解纤维素，为内切酶的工业应用奠定了基础。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张学文 田志坚 吴永尧 周双德 康冬丽
为了通过基因工程方法在大肠杆菌中发酵生产β-甘露聚糖酶,采用多重比较几种来源的β-甘露聚糖酶氨基酸序列,获得了该酶的保守结构域,并按此设计简并引物.以能水解魔芋葡甘聚糖的枯草杆菌属野生筛选菌种A33为材料,通过简并引物PCR法从A33基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因核心区段.经过克隆、测序及BLASTN比对分析,证实该DNA区段推导的编码蛋白具有β-甘露聚糖酶的保守结构域,属于该酶家族中的一员.将该片段构建到大肠杆菌表达载体pRSET-A并转入大肠杆菌表达系统BL21DE3(pLysS),经过诱导获得了此酶的高效表达.
关键词：
β-甘露聚糖酶 基因克隆 表达
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
崔罗生 祝茂生 徐顺清 朱辉 梁运祥 张忠明
从黑曲霉(Aspergillus niger)F19中克隆得到木聚糖酶基因xynA。将不带原基因信号肽编码序列的xynA基因片段以正确的阅读框架克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET-28a(+)上,并转化E.co-liBL21,获得重组工程菌BLX1。经过IPTG诱导,xynA获得特异性表达,其表达产物以包涵体和胞内可溶性蛋白2种形式存在。经过SDS-PAGE分析,重组蛋白分子质量约为24 ku。酶学分析表明,最适反应温度为50℃,最适反应pH为5.0,在酸性条件下具有较好的稳定性。
关键词：
黑曲霉 木聚糖酶 xynA基因 酶学性质
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
闫建英 张智 冯丽荣 汤华京 杨可心 魏罡 张晓彤
【目的】在枯草芽孢杆菌中表达绿色木霉(Trichodoma vivide,T.viride)内切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ。研究内切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ的生物信息、基因克隆与表达及重组酶学性质。【方法】提取纤维素酶生产菌株绿色木霉AS3.3711的总RNA，通过反转录合成cDNA，并以之为模板利用PCR技术扩增获得内切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ，并进行生物信息学分析；构建了重组表达载体pMA5-Eg Ⅶ，并利用热激转化法将其转入枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis,B.subtilis）WB600感受态细胞中，成功进行表达。【结果】生物信息学分析表明，内切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ编码249个氨基酸，蛋白质的分子量为26.8002 KD，理论等电点7.62，属于胞外蛋白；预测蛋白质三级结构与二级结构一致，由ɑ-螺旋、延伸链区、β-转角和无规则卷曲构成。电泳结果表示，重组枯草芽孢杆菌在Eg Ⅶ基因片段大小符合处出现条带，表明成功将Eg Ⅶ-pMA5转化到B.subtilis WB600中。刚果红染色结果显示重组枯草芽孢杆菌在CMC培养基上出现较大直径的透明圈，重组菌株上清粗酶液DNS酶活力达到22.71 U/mL，表明绿色木霉内切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ可以在枯草芽孢杆菌中表达，并具有较高活性。重组酶酶学性质分析表明，该酶的最适温度是60℃，最适pH值为6.4，且温度在50℃以下，pH值在5.6～8.0范围内，酶活力具有良好的稳定性。【结论】通过对内切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ克隆及分析，获得了表达内切葡聚糖酶基因Eg Ⅶ的枯草芽孢杆菌基因工程菌，了解了重组酶酶学性质，为纤维素酶的广泛应用提供了理论基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
文凤云 廖富蘋 林健荣 钟杨生
【目的】克隆多粘类芽孢杆菌(Paenibaccillus polymyxa)CP7的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因,构建高效表达工程菌株,为CP7菌的抗菌活性组分研究和开发利用以及葡聚糖酶在农业生产中的应用提供理论依据。【方法】通过CP7菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及原核表达构建工程菌株,采用平板对峙培养和生长速率测定法研究重组酶对供试真菌的生长抑制活性,同时采用体外消化法研究该酶对麦类饲料消化率的影响。【结果】成功克隆目的基因并在原核系统获得高效表达。重组酶蛋白对4种供试真菌菌丝生长具有明显抑制作用,平均抑制率高达40%以上;添加了重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的处理组样品,...
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
闻雅男 王学英 夏润玺 王媛媛
为获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生物生物制剂,从自行筛选的黑曲霉中提取RNA,通过反转录合成模板cDNA,根据phyA成熟肽编码序列设计出一对引物,PCR扩增phyA,对扩增片段进行了克隆,通过限制性内切酶酶切分析、DNA测序证明phyA基因克隆成功。从pBS-T-phyA克隆中获取phyA编码序列,将其与pET28a+质粒连接,构建pET28a+-phyA重组质粒,并在大肠杆菌中获得高效表达。本研究成功克隆phyA,该基因全长1404bp,以ATG为起始密码子,TGA为终止密码子,编码467个氨基酸组成的多肽。SDS-PAGE电泳结果表明,phyA在大肠杆菌中成功表达,成熟植酸酶...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
杨玉霞 张慧玲 汪艳 陈勇
为实现瘤胃细菌产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因(FsGLU)的高效表达,开发新的饲用β-葡聚糖酶资源,根据毕赤酵母对密码子的偏爱性、G+C含量等特点,对FsGLU基因进行密码子优化,然后合成优化后的1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因(FsGLUm),转化毕赤酵母GS115,以甲醇诱导表达并对重组FsGLUm的酶学特性、底物特异性和对消化酶的耐受性进行了研究。结果表明:摇瓶水平条件下,以甲醇诱导表达48 h时,重组FsGLUm酶活性提高25.1%(P
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
徐顺清 陈杏洲 崔罗生 梁运祥 张忠明
通过PCR扩增从乳酸克鲁维酵母基因组获得乳糖酶基因lac4,将其克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a(+),并在大肠杆菌BL21中获得表达,酶活性达(44.78±2.84)U/mL。利用Ni-ResinHP亲和层析技术纯化该酶,SDS-PAGE分析表明,重组酶分子质量约为122ku。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度为43℃,37℃时半衰期为30min,最适反应pH为7.0,在pH4.0～10.0范围内有良好的稳定性,Ca2+、Zn2+、Fe2+、Co2+、Mg2+、Mn2+对酶有非常明显的激活作用,比酶活性为(255.55±2.32)U/mg,酶反应常数Km为3.49mmol/L,最大反应速...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李晶晶 赵德明 徐广贤 周向梅 尹晓敏
为观察重组MPB83蛋白的免疫活性,揭示该蛋白在牛结核病的诊断和防治中的作用,克隆了牛分枝杆菌MPB83基因,构建了克隆载体pGEM-MPB83和表达载体pET30a-MPB83,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。试验结果表明:牛分枝杆菌MPB83基因体外扩增产物与预期值相符,约600 bp;所构建表达质粒pET30a-MPB83经测序,结果与预期一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以包涵体的形式表达,其分子质量约为26 ku,蛋白表达量占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达95%以上;免疫印迹分析表明,...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张倩 廖玉才 陈方方 董璇 李和平
通过PCR克隆了大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因manA,分别构建了含manA基因的原核和真核生物表达载体。在大肠杆菌中经IPTG诱导表达的GST-PMI融合蛋白,经亲和层析纯化和PreScission蛋白酶酶切,SDS-PAGE分析证实PMI蛋白为42 ku。对转manA基因的拟南芥进行PCR分析表明,manA基因已稳定整合到拟南芥基因组中。氯酚红显色反应证实,整合到拟南芥基因组中的manA基因能表达具有6-磷酸甘露糖异构酶活性的PMI蛋白。这些结果说明,克隆的manA基因可在细菌和高等植物中高效表达。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
熊帅 张军科 谌悦
【目的】从富士苹果幼果果实中克隆多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因,并进行原核表达,为进一步研究PGIP的生物学功能奠定基础。【方法】根据Genbank中已经发表的苹果PGIP基因序列设计引物,采用RT-PCR从苹果果实中扩增PGIP基因cDNA,回收目的基因片段并连接到pMD18-T载体,鉴定后进行测序。然后将PGIP全长cDNA和去信号肽的cDNA导入到pET-32a(+)表达载体中,分别获得融合表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X,将其分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用不同终浓度IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳。对pET-PGIP-X基因工...
[期刊] 草业科学
[作者]
刁桂萍 杨帅 遇文婧
从棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ACCC30536中克隆获得一个葡聚糖酶基因Glu1,其cDNA全长984bp,编码327个氨基酸。该葡聚糖酶属于Glyco-hydro-12家族,推测为β-1,4-葡聚糖酶,与深绿木霉IMI 206040的Glycohydro-12家族蛋白(XP_013940397.1)有91%相似性,且亲缘关系较近。运用qRT-PCR技术检测9种诱导条件下棘孢木霉Glu1基因的表达水平,结果表明,Glu1基因能参与棘孢木霉对山新杨(Populus davidiana×P.alba var.pyramidlis)或杨树病原菌的识别。构建原核表达载体并获得重组蛋白rGlu1。酶活特性分析结果表明,该酶最适pH为4.5,最适温度为45℃,且酶活性随诱导时间延长逐渐升高,在5h达到稳定。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
龚月生 刘锦妮 王晶 杨明明 袁新宇
【目的】研究耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达,并检测其酶学性质,为耐热β-半乳糖苷酶的应用和工业化生产奠定基础。【方法】利用基因工程的原理和方法,将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶基因(bgaB)克隆到大肠杆菌pET表达系统(pET-28a(+)),并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。将构建的重组菌(pET28a-bgaB)在含硫酸卡那霉素的液体LB培养基中以IPTG为诱导剂,对表达产物的最适反应温度、最适反应时间I、PTG诱导浓度、热稳定性及酶促动力学进行检测。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bgaB,并测得耐热β-半乳糖苷酶的最适反应温度为65℃,最适反应时...
关键词：
β-半乳糖苷酶基因 大肠杆菌 酶学性质
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
于寒颖 杨谦
不含有内含子的核盘菌arom基因已经被扩增、测序.该基因编码五功能的AROM蛋白.为了大量获得核盘菌AROM蛋白的结构域之一5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS),将该菌arom基因编码脱氢奎尼酸合酶(DHQS)和EPSPS两结构域的DNA序列和只编码EPSPS结构域的DNA序列分别克隆入载体pGEX-4t-2和载体pET28b中,构建了4个表达载体pGEX-DE、pGEX-E、pET-DE和pET-E,并将其转入大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌JM109中表达.酶活测定和SDS-PAGE分析结果显示,上述编码序列在大肠杆菌细胞内获得了表达,含有表达载体pGEX...
关键词：
基因表达 核盘菌 arom基因 大肠杆菌
[期刊] 中国农业科学
[作者]
范晓静 杨瑞先 邱思鑫 胡方平
【目的】克隆植物内生解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BS2的β-1,4-内切葡聚糖酶基因(β-1,4-endoglucanase gene,eglS),探明BS2中该基因与定殖的相关性。【方法】以枯草芽孢杆菌BS168基因组为模板扩增组成型启动子rpsD。依据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因的同源序列设计1对引物,以BS2基因组为模板扩增eglS。将rpsD启动子基因和eglS片段用T4连接酶连接,并对连接产物进行PCR扩增,得到eglS表达盒片段。将表达盒片段插入穿梭载体pGFP4412用以构建eglS过表达质粒。设计引物扩增eglS的同源重组片段,...
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