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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
文征宇 侯文韬 杨龙雨 陈鹏
【目的】建立牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ(Vaccinia topoisomeraseⅠ)的原核表达体系及纯化方法,以获得高活性、高纯度的牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ。【方法】优化并人工合成牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ的全基因序列,构建牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ的原核表达载体(pET28a/TOPO)并转化E.coliBL21 Star(DE3)菌株,优化其诱导表达条件,表达蛋白经Talon his-tag purification resin螯合层析柱纯化,用SDS-PAGE鉴定纯化效果,借助酶切质粒pLLP-OmpA检测纯化蛋白的活性。【结果】转化pET28a/TOPO的E.coliBL21 Star(DE3)特异地表...
关键词：
牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ 原核表达 蛋白纯化
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
陈轶霞 王明明 龙玲 邵忠伟 刘俊林
通过计算机软件筛选出绵羊痘病毒基因组中心编码区的ORF90核蛋白、ORF112融合蛋白、ORF117糖蛋白、ORF55膜蛋白和基因组末端的ORF134宿主范围相关基因的6段T、B细胞优势抗原表位,以柔性氨基酸(GPGPG)作为接头，串联合成1条全新的多表位嵌合基因mE，将其克隆到原核表达载体pET-32中，采用酶切分析与序列测定方法筛选鉴定阳性重组质粒，构建pET32-mE质粒；用IPTG在不同条件下诱导表达，确定最佳表达条件，表达产物经SDS-PAGE分析。结果表明，重组蛋白是分子质量为41 ku的融合蛋白。在IPTG浓度为0.5 mmol/L，温度为37℃、诱导4 h时目的蛋白的表达量最...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
陈轶霞 王明明 龙玲 邵忠伟 刘俊林
通过计算机软件筛选出绵羊痘病毒基因组中心编码区的ORF90核蛋白、ORF112融合蛋白、ORF117糖蛋白、ORF55膜蛋白和基因组末端的ORF134宿主范围相关基因的6段T、B细胞优势抗原表位,以柔性氨基酸(GPGPG)作为接头,串联合成1条全新的多表位嵌合基因mE,将其克隆到原核表达载体pET-32中,采用酶切分析与序列测定方法筛选鉴定阳性重组质粒,构建pET32-mE质粒;用IPTG在不同条件下诱导表达,确定最佳表达条件,表达产物经SDS-PAGE分析。结果表明,重组蛋白是分子质量为41ku的融合蛋白。在IPTG浓度为0.5mmol/L,温度为37℃、诱导4h时目的蛋白的表达量最大,约占...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
陈珍珍 曾显成 池雪林 白丁平 刘云辉 胡可慧 罗树红 黄小红
本试验旨在原核表达、纯化羊口疮病毒ORF080蛋白并鉴定其反应性.根据GenBank已发表的羊口疮病毒OV-GO株ORF080基因序列(登录号:KP010354),将密码子优化后合成该序列并克隆至pET-32a(+)原核表达载体中,构建pET-32a(+)-ORF080重组质粒.经双酶切和测序鉴定后转化至大肠杆菌Rossetta感受态细胞中,用IPTG诱导,诱导产物经SDS-PAGE鉴定,重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式获得表达.采用镍柱对可溶性重组蛋白进行纯化,再经SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹双重鉴定.SDS-PAGE检测结果显示,在57 ku处出现单一重组蛋白条带;蛋白质免疫印迹鉴定证实该纯化的蛋白能与抗组氨酸标签的抗体和羊口疮阳性血清发生特异性反应,证明成功表达并纯化出具有良好反应性的ORF080蛋白.试验结果为进一步对ORF080蛋白结构、功能及基因工程疫苗的研究提供参考.
关键词：
羊口疮病毒 ORF080蛋白 原核表达
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
屈亚平 张智俊 王超莉 王蕾 吴林军
毛竹Ｐｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｅｄｕｌｉｓ阿拉伯糖－５－磷酸异构酶（Ｐｅ Ｋｄｓ ｄ）是２－酮－３－脱氧辛糖酸（Ｋｄｏ）生物合成途径的第１个关键酶。采用逆转录实时聚合酶链式反应（ｑ Ｒｔ－ＰｃＲ）克隆得到毛竹Ｋｄｓ ｄ基因。该基因ｃ ｄＮａ全长１ ０３８ ｂＰ，编码３４６个氨基酸；对不同物种来源的Ｋｄｓ ｄ氨基酸序列进行比对和系统进化树分析。结果表明：毛竹的Ｋｄｓ ｄ与玉米Ｚｅａ ｍａｙｓ等植物来源的Ｋｄｓ ｄ有很高的序列一致性，而与微生物来源的Ｋｄｓ ｄ序列一致性较低。毛竹不同组织实时荧光定量聚合酶链式反应（ｑ Ｒｔ－ＰｃＲ）结果表明：Ｐｅ Ｋｄｓ ｄ基因在叶中表达量远远高于其他组织。在大．．．
[期刊] 林业科学研究
[作者]
李娜 李恩杰 王青华 王玉珠 张永安 段立清
[目的]根据Ikdea对Hycu NPV全基因组序列的分析,筛选出功能还未被研究的、保守性高的ORF72基因。[方法]将ORF72基因构建到原核表达载体p GEX-4T-1上,对其进行诱导表达,优化表达的条件,并通过GST亲和层析色谱柱纯化融合蛋白。[结果]重组质粒p GEX-4T-1-ORF72的酶切检测以及测序结果均正确,证明重组质粒载体构建成功。通过SDS-PAGE凝胶电泳显示,ORF72蛋白能够与p GEX-4T-1载体上的GST标签蛋白进行融合表达,诱导表达后的融合蛋白大小约为38. 2 k Da。优化后的表达条件为:异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导浓度为1. 0 mmol·L-1,最佳诱导温度为25℃,最佳诱导时间为4 h,并且该蛋白在大肠杆菌BL21和Rosetta表达菌株中均能很好的表达,但在Rosetta菌株中表达量更高。[结论]成功构建了p GEX-4T-1-ORF72原核表达载体,确定出ORF72融合蛋白最佳诱导表达条件,诱导表达并纯化出ORF72融合蛋白,为进一步研究其生物功能奠定基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
翟留涛 秦魏 刘娜女 奚绪光
【目的】通过大肠杆菌表达纯化牛(Bos taurus)RECQL蛋白,利用停流光谱技术对解旋条件进行优化,为研究RECQL的酶促反应动力过程奠定基础。【方法】将人工合成的牛RECQL蛋白编码序列与pET21a载体相连接,获得重组表达载体pET21a-BtRecql后,将其导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达,经过Ni-NTA亲和层析和Superdex 200凝胶过滤层析,得到纯化的重组蛋白BtRECQL;再利用停流光谱技术对BtRECQL解旋过程进行检测分析,通过摸索不同的试验参数找到BtRE
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵冬敏 黄欣梅 刘宇卓 张敬峰 韩凯凯 谢星星 周晓波 李银
根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增得到完整的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a和pET32a上,构建出重组表达质粒pET28a-NS1和pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到NS1融合蛋白(His-NS1),其分子质量约分别为44,58 kDa,均在诱导后6 h达到表达量高峰。分析显示,2种融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于鹅坦布苏病毒NS1蛋白的研究奠定了基础。
关键词：
鹅坦布苏病毒 NS1蛋白 原核表达
[期刊] 水产学报
[作者]
刘林 徐诗英 李婧慧 邹勇 倪金俤 杨鸢劼 曹广力 薛仁宇 陈辉 贡成良
为了探讨草鱼出血病病毒(GCRV)VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用,将vp6基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),构建了重组质粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western-blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为43 ku,主要以包涵体形式存在,重组蛋白占菌体总蛋白的20%左右;Ni2+柱纯化后的重组蛋白,以每尾500μg肌肉注射免疫草鱼(14～20 cm,60～120 g),并在第14、21、28、49、70天通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,免疫注射后第14天可检测到鱼体产生的特异性抗体,第21天达到最高峰,第70天仍可检测到抗体的存在;免疫...
关键词：
草鱼出血病病毒 原核表达 纯化 免疫
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨艳艳 王丽 杨继飞 郅玉宝 滕蔓 邓瑞广 肖治军 张改平
利用RT-PCR技术,将狂犬病病毒株ERA株糖蛋白胞外区基因分两段进行扩增,经克隆与序列分析,两片段大小分别为523,381 bp,各编码174,127个氨基酸,分子量分别为19.7,14.5 kDa。在原核表达载体pET-43a中分别克隆了这两段糖蛋白基因,将重组质粒转化到表达菌BL21(DE3)中,经SDS-PAGE电泳分析,在分子量约为94,89kDa处分别出现新蛋白带,和预期的目的蛋白的分子量相符。两重组蛋白主要以可溶形式表达,利用Ni2+亲和层析柱纯化了蛋白,纯度大于95%。Western-Blot分析结果显示,两种重组融合蛋白均可与兔抗RBV多抗血清反应,具有良好的反应原性。
关键词：
狂犬病病毒 糖蛋白 胞外区 纯化
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
丁巧玲 陈溥言
将马立克氏病病毒 (MDV)gB基因插入鸡痘病毒 (FPV)中 ,构建了含有MDVgB基因的重组鸡痘病毒 (rFPV)。用rFPV、HVT冻干苗、rFPV +HVT疫苗分别免疫 1日龄AA肉用雏鸡 ,于 8日龄攻毒后观察疫苗免疫效果。实验结果表明 ,HVT、rFPV、HVT +rFPV疫苗免疫组比攻毒对照组病毒血症持续时间短 ;上述 3种疫苗免疫后用京 1株MDV(vMDV)攻毒 ,脾脏T淋巴细胞增殖反应处于较高水平 ,而攻毒对照组脾脏T淋巴细胞增殖反应减弱 ,两者差异显著(P
[期刊] 华北农学报
[作者]
姜楠 郑倩倩 李倩文 涂健 宋祥军 邵颖 刘红梅 祁克宗
兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室前期预测了新的ETT2伴侣分子YgeG,为了获得大量有活性的YgeG蛋白,对其功能进行鉴定,并筛选出与其相关的具有活性的ETT2分泌效应蛋白,将对目的蛋白原核表达条件进行优化。以禽致病性大肠杆菌菌株81(AE81)为模板对基因ygeG进行扩增,将扩增产物克隆至pGEX-6p-1原核表达载体,构建重组质粒pGEX-6p-1-ygeG,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化。SDS-PAGE及Western Blot鉴定结果显示,本试验中表达的最佳条件为:IPTG终浓度为0.25 mmol/L,16℃诱导16 h。重组蛋白大小约为44 ku,在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中高效表达,主要以可溶性蛋白的形式存在,并且具有良好的免疫原性和反应原性。成功表达了AE81-YgeG蛋白,为该蛋白的结构和功能及ETT2的深入研究奠定基础,为禽大肠杆菌病的防治提供理论依据。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李波 倪志勇 范玲
为了深入研究GhCOMT3基因的功能,将GhCOMT3基因构建到原核表达载体pET-28a中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。用0.2mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,结果发现,16℃诱导12h、30℃诱导3h和37℃诱导3h后融合蛋白均以包涵体的形式表达;30℃诱导的蛋白表达量最大,之后对包涵体进行变性溶解,进行SDS-PAGE检测,再经过蛋白标记亲和层析柱(His TrapTMHP)纯化得到变性的pET-28a-GhCOMT3融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化效果,鉴定表达产物,目的蛋白相对分子量约为39.119kDa,检测结果与预期一致。结...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孟星宇 李婷 李沐 刘宁 田玉华 胡薇
【目的】克隆梅花鹿(Cervus nippon)胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)的成熟肽基因,并对其进行原核表达及纯化,以获得具有生物学活性的蛋白,为研究IGF-1在梅花鹿鹿茸生长发育中的调控作用及机理提供参考。【方法】以GenBank中的梅花鹿IGF-1基因序列(登录号:HQ890468)设计1对引物,以构建的梅花鹿pMD-18T-IGF-1重组质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽的基因序列,构建重组质粒pMD-IGF-1,将其插入pET-32a表达载体后,构建pET-32a-IGF-1质粒,鉴定后,将pET-32a-IGF-1转入Ros...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张伟 李翠萍 杨志军 何广杰
采集红鳍东方鲀脂肪组织提取其总ＲＮＡ，采用ＲＴ–ＰＣＲ方法扩增和克隆红鳍东方鲀Ｆｏｘｏ１基因的ｏＲＦ，并构建其原核表达载体Ｐ ＥＴ–３２／Ｆｏｘｏ１，在大肠杆菌ＲｏｓＥＴＴＡ（ＤＥ３）进行表达，通过ＩＰＴＧ诱导表达，对重组Ｆｏｘｏ１蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定，结果表明：重组质粒Ｐ ＥＴ３２Ａ／Ｆｏｘｏ１被成功构建；用ＩＰＴＧ进行诱导表达，融合蛋白主要以可溶蛋白形式存在，能与抗ＨＩｓ标签的兔多克隆抗体发生特异性反应；纯化出了融合表达蛋白，获得了相对分子质量约为１１０ ０００的重组蛋白。
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