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[期刊] 中国农业科学
[作者]
贾立军 张守发
【目的】构建表达牛源犬新孢子虫NcSAG1基因的重组腺病毒株,并接种Balb/c小鼠,评价重组腺病毒株对Balb/c小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平。【方法】PCR扩增牛源犬新孢子虫NcSAG1基因,构建pMD18-T-NcSAG1克隆质粒和pCR259-NcSAG1重组腺病毒穿梭质粒;将鉴定正确的pCR259-NcSAG1重组腺病毒穿梭质粒依次转化HighQ-1 Transpose-Ad 294和HighQ-1感受态细胞,构建Transpose-Ad-NcSAG1重组腺病毒表达质粒;PacI酶切线性化后,脂质体介导转染QBI-HEK 293细胞包装重组腺病毒Ad5-NcSAG1,应用PCR和...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孙永科 杨玉艾 王养会 李普华 张彦明
用已构建好的表达猪瘟病毒石门株E0基因的重组腺病毒pAd-E0、表达猪瘟病毒石门株E2基因的重组腺病毒pAd-E2以及联合表达猪瘟病毒石门株E0-E2基因的重组腺病毒pAd-E0-E2,肌肉和皮下接种免疫商品猪2次(间隔20 d),同时设非重组腺病毒PAD-CMV、常规猪瘟疫苗和空白对照组。二免21 d后进行CSFV石门株强毒超致死量(1 000倍TCID50)攻击,研究表达猪瘟保护性抗原基因重组腺病毒疫苗的免疫效果。结果表明,pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2免疫组猪的死亡率分别为50%,25%和25%,而常规猪瘟兔化弱毒疫苗免疫组的死亡率为40%,pAd-CMV免疫组和空白对照...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
魏胜娟 昝林森 王洪宝 成功 季舒涵 王虹 付常振 姜碧杰
【目的】旨在通过构建秦川牛FABP4基因的重组腺病毒载体,为在细胞水平研究FABP4基因的功能和作用机制做准备。【方法】根据GenBank收录的牛FABP4基因mRNA序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV上并用PmeⅠ线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的E.coli BJ5183感受态细胞进行同源重组,得到重组质粒pAd-FABP4,并用PacⅠ酶切鉴定。将经过PacⅠ线性化的pAd-FABP4转染HEK 293A细胞进行病毒包装和扩增,TCID50法测定病毒滴度。【结果】经测序鉴定本次克隆的FABP4序列与GenBank收录的一...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
付常振 昝林森 王虹 成功 王洪宝 李耀坤 姜碧杰 高建斌 杨宁
【目的】筛选可靶向干扰牛的SREBP1基因的有效shRNA,构建相应腺病毒载体并包装重组腺病毒,为在细胞水平上研究SREBP1基因的功能和作用机制提供基础。【方法】以秦川牛SREBP1基因为研究对象,首先靶向其编码区(coding sequence,CDS)序列设计并合成6条干扰和1条阴性对照shRNA,并构建表达载体pENTR-U6-shRNA。然后与载体psiCHECK-Ⅱ-SREBP1共转染293A细胞,筛选有效的pENTR-U6-shRNA。其次将筛选的pENTR-U6-shRNA和阴性对照pENTR-U6-NC分别与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST体外重组,得到腺病毒重组载体,并...
关键词：
牛 SREBP1 shRNA 重组腺病毒
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张琼 姜碧杰 成功 刘扬 昝林森
【目的】构建秦川牛ADIG基因的重组腺病毒载体,包装并扩繁病毒,为下一步研究该基因在脂肪细胞分化过程中的分子作用机制和相关信号通路奠定基础。【方法】根据NCBI收录的家牛ADIG基因(NM_001113720.1)mRNA序列设计引物,以秦川牛组织样提取的总RNA反转录而成的cDNA为模板,通过RT-PCR和PCR扩增获得目的基因,将其连接到pMD19-T Simple载体并测序。质粒提取纯化后通过BglⅡ与SalⅠ双酶切,然后胶回收酶切产物,将其连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack/CMV-ADIG。将pAdTrack/CMV-ADIG质粒用PmeⅠ酶...
关键词：
ADIG 腺病毒 同源重组 秦川牛
[期刊] 中国农业科学
[作者]
展小过 乔传玲 杨焕良 陈艳 孔维 辛晓光 陈化兰
【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,将其亚克隆入质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有H3HA及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP。利用脂质体转染方法将穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
黄凯 林亚秋 朱江江 马洁琼 王永
【目的】为利用超表达手段进一步研究成纤维细胞生长因子1(FGF1)基因对山羊肌内前体脂肪细胞分化过程的影响。【方法】本试验通过构建p Ad Track-CMV-FGF1穿梭质粒,转入含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组,获得腺病毒超表达载体pAdEasy-FGF1,经Pac I酶切鉴定后转染293A细胞进行病毒的包装与扩繁,最后用包装的pAdEasy-FGF1感染山羊肌内前体脂肪细胞,检测感染前后FGF1的表达变化。【结果】成功构建了腺病毒超表达载体p AdEasyFGF1,并在293A细胞中成功包装,其感染山羊肌内前体脂肪细胞能显著上调FGF1 mRNA的表达水平。【结论】说明FGF1基因可以通过感染重组腺病毒表达载体pAdEasy-FGF1在山羊肌内前体脂肪细胞中实现超表达。
关键词：
山羊 成纤维细胞生长因子1 腺病毒
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李小凤 阮志华 石勇丽 武晓倩 韦悠 万丽军 谢志勤 任红玉 谢芝勋
【目的】分析血清4型禽腺病毒（FAdV-4）Ⅷ蛋白（Protein Ⅷ，pⅧ）对宿主天然免疫相关基因表达的影响，为进一步研究FAdV-4的致病机理提供参考依据。【方法】通过PCR扩增FAdV-4Ⅷ基因编码区序列，与pEF1α-HA载体连接，构建重组表达质粒pEF1α-HA-Ⅷ。用pEF1α-HA-Ⅷ重组表达质粒（试验组）和pEF1α-HA空质粒（对照组）转染LMH细胞，利用Western blotting和间接免疫荧光验证Ⅷ蛋白表达情况，实时荧光定量PCR测定STING、MDA5、TBK1、MAVS、NF-ΚB、IRF7、IFN-α、INF-β、IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β基因的表达水平。【结果】Ⅷ基因开放阅读框（ORF）全长744 bp，共编码247个氨基酸残基，真核表达获得的Ⅷ重组蛋白与鼠源HA标签单克隆抗体产生特异性反应，在34 kD处得到单一条带；间接免疫荧光检测可见绿色荧光，说明Ⅷ重组蛋白在LMH细胞中得到良好表达。与对照组相比，Ⅷ重组蛋白在LMH细胞中表达后，模式受体STING基因的表达水平显著提高了5.6倍（P<0.05，下同），MDA5基因的表达水平提高了30%；接头蛋白TBK1和MAVS基因表达水平分别较对照组显著提高了1.5和2.4倍；转录因子IRF7的表达水平显著提高了3.4倍，而NF-ΚB基因被抑制表达。同时，干扰素（IFN-α和IFN-β）和白介素（IL-6、IL-8、IL-15和IL-1β的表达水平均上调，IFN-α和IFN-β分别极显著上调19.2和14.4倍（P
[期刊] 华北农学报
[作者]
黄娟 隋晓梅 王怡男 单虎
为了弄清是否有新基因型犬瘟热病毒出现，对山东省不同地区的免疫水貂、狐狸和犬进行了犬瘟热病毒检测，扩增了病毒核衣壳基因和血凝素基因（Ｈ），并对１３个犬瘟热病毒山东株（８株貂源，２株狐狸源，３株犬源）血凝素基因进行了测序。结果表明，１３个犬瘟热病毒山东株之间Ｈ基因核苷酸同源性为９９．１％～１００．０％，均为ＡｓｉＡ－１型，这也是我国目前水貂犬瘟热病毒唯一的基因型。与２０１２年之前的犬瘟热病毒中国分离株及疫苗株相比，１３个毒株Ｈ基因有４个氨基酸的一致性变异，即Ｐ２００ｓ、Ｍ２６３ｉ、ｉ５４２Ｎ和Ｙ５４９Ｈ，Ｎ－糖基化位点比ＯＮｄｅｒｓｔｅＰＯＯｒｔ株多６或７个，比ＣｄＶ３株多３或４个。抗原性分析表明．．．
关键词：
犬瘟热病毒 血凝素基因 免疫失败
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨玉艾 孙永科 华进联 窦忠英
为了探讨心肌肌动蛋白(α-actin)基因启动子的心肌组织特异性及其表达活性,构建了心肌组织靶向性表达的基因载体,应用PCR从pEGFP-N1-α-actin-P质粒中克隆出α-actin启动子片段,将其插入到切除CMV启动子的腺病毒穿梭载体pAdTrack中,构建出pAdTrack-actin重组穿梭载体,经酶切和测序鉴定正确后用PmeI线性化,与含有腺病毒骨架DNA的pAdEasy-1质粒在BJ5183大肠杆菌细胞中同源重组成新的重组体pAd-easy-actin,抽提重组体DNA,经PacI酶切回收后以脂质体法转染人胚肾细胞株HEK293,包装出完整腺病毒pAd-actin进行PCR检测...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李守湖 范玉锋 高欣 李宝玉 吴鹏程 胡永浩 柳纪省
【目的】克隆传染性造血器官坏死症病毒（IHNV）G基因，构建其重组腺病毒载体，为IHN预防及疫苗的研制提供参考。【方法】通过RT-PCR和PCR技术扩增IHNV G基因，将G基因插入到腺病毒穿梭载体中，再用带有目的基因的腺病毒载体与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组，构建重组腺病毒质粒，通过PCR扩增及Sal Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定，经PacⅠ酶切后转染HEK-293细胞进行包装，获得带有目的基因的重组腺病毒，通过观察绿色荧光蛋白表达情况来监控重组腺病毒，用Western-blot法检测糖蛋白的表
关键词：
传染性造血器官坏死症 G基因 腺病毒载体
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张优优 徐坤 王亮亮 张婷婷 辛颖 任充华 闫强 张智英
【目的】扩增大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA和orfC,制备orfA和orfC重组腺病毒,并感染Hela229和SPC-A-1细胞,以检测orfA和orfC对肿瘤细胞的影响。【方法】从pWDSV全长表达载体中扩增WDSV辅助基因orfA和orfC,构建orfA和orfC基因的重组腺病毒载体以及对照空载体,采用脂质体介导法转染HEK293细胞进行包装和扩增,用绿色荧光蛋白法测定重组腺病毒的滴度;将重组腺病毒转染肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1,采用Weastern Blot方法检测基因orfA和orfC的表达情况,并用MTT法检测其对肿瘤细胞Hela229和SPC-A-1...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
魏燕鸣 龚文孝 杨影 马季 邹忠 金梅林
为建立禽腺病毒4型的禽源细胞感染模型,并考察细胞培养毒株对动物的致病性,将实验室2014-2017年间分离的5株血清4型禽腺病毒接种鸡肝癌细胞(leghorn male hepatocellular cells,LMH)并盲传,选取各病毒的LMH细胞培养物,按一定剂量经腿部肌肉注射接种4周龄SPF鸡;记录试验动物的发病情况,剖检采集发病或死亡鸡的脏器并制作病理切片,观察并分析病毒细胞培养物感染SPF鸡的组织病理变化。结果发现:5株血清4型禽腺病毒在LMH细胞上盲传至第4代时开始出现I群禽腺病毒所致的特异性细胞病变,提取培养物中病毒核酸并进行PCR鉴定,均能扩增出大小约564bp的特异性扩增片段,表明病毒能在LMH细胞上稳定增殖。选取各病毒第10代细胞培养物进行SPF鸡回归试验,发现细胞培养上清接种4周龄SPF鸡后第3天开始,有部分鸡开始精神沉郁,食欲消退、卧地不起瘫痪并迅速死亡,病理剖检及病理组织切片结果显示HB-1、HB-2、HB-3和SD-1毒株保持对4周龄SPF鸡的致病性,病死鸡中能观察到典型的组织病理学变化,而对照组不出现任何临床症状及病理变化。以上结果表明,LMH细胞可用于禽腺病毒增殖传代,是开展禽腺病毒分子致病机制研究的理想细胞模型。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙岩 仲飞 李秀锦 王幸兴 王璐 贾启恒 韩冬梅 李振 张峰 潘红丽
【目的】白介素-7是动物体一种重要的多功能细胞因子,在促进B细胞、T细胞的形成和发育,在协同其它细胞因子提高机体免疫能力等方面发挥重要作用。本试验利用犬细小病毒VP2 DNA疫苗,在小鼠体内分析了犬白介素-7(cIL-7)基因的免疫增强作用。【方法】采用RT-PCR方法从犬脾淋巴细胞中扩增cIL-7基因,然后将cIL-7基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,分别构建成与Myc/His标签融合和非融合的cIL-7真核分泌型表达载体pcDNA-cIL7/MH和pcDNA-cIL7。由磷酸钙介导将pcDNA-cIL7/MH质粒转染HEK 293T细胞使其进行瞬时表达,以Western-blot...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
葛金英 温志远 高宏雷 王永 胡森 鲍恩东 王笑梅 步志高
【目的】重组新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)作为新型的活病毒载体疫苗具有巨大的优势和应用前景,本研究旨在探讨新城疫病毒作为防制传染性法氏囊病超强毒(very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV)及新城疫重组二联活病毒载体疫苗的可行性。【方法】采用单股负链RNA病毒反向遗传操作技术,救获野生型NDV LaSota疫苗株rLaSota及表达vvIBDV Gx株VP2基因的重组疫苗株rLaSota-VP2,分别经滴鼻点眼途径免疫SPF雏鸡,免疫后21d分别以vvIBDVGx超强毒和新城疫强毒进行攻击。【结...
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