对牛早期胚胎性别鉴定PCR反应体系及反应程序进行了优化。结果显示,选用双套引物和连续复合PCR方法,先用雄性特异性引物进行10个循环,然后再加入牛特异性引物进行22个循环,共32个循环,可实现两种基因片段的同时扩增,保证了PCR的准确性。胚胎移植结果显示该方法准确可靠。

根据公牛Y-染色体特异重复序列和公母牛共有的DNA序列,设计并合成PCR引物用于牛或牛胚胎性别鉴定,通过PCR反应对公母牛静脉血及牛胚胎进行性别鉴定,结果表明,母牛只能扩增出250 bp的内标基因片段,而公牛能同时扩增出131 bp的Y-染色体特异性基因片段和250 bp的内标基因片段。静脉血样与实际性别的符合率为100%;4~10个胚胎细胞的扩增也出现和静脉血相同的特异条带。这表明该检测方法准确、简便,具有较高的灵敏性和稳定性。

为获得一种高效的牛胚胎性别鉴定方法,采用高特异性和灵敏度的巢式PCR进行扩增。结果表明:公牛可以扩增出187bp的SRY基因片段和255bp的β-珠蛋白基因片段,母牛只能扩增出255bp的β-珠蛋白基因片段。巢式PCR只需3～8个细胞就可以观察到扩增结果,而常规PCR则需要较多的细胞,所以牛胚胎性别鉴定时使用巢式PCR效果更好。

根据牛Y染色体特异重复序列设计合成5对牛Y染色体特异引物,依据牛微卫星基因设计合成3对牛染色体内标引物。每对引物分别扩增牛基因组DNA,筛选出2对牛Y染色体特异引物和1对牛DNA特异内标引物。通过对多重PCR扩增条件进行优化组合,建立1个可用于牛早期胚胎性别鉴别的多重PCR方法及引物组合:BY1/A1。

根据牛SRY基因序列设计合成了2对嵌套式引物作为公牛特异性引物,同时根据牛β珠蛋白基因(HBB)序列设计了1对引物作为内参照引物,建立了巢式PCR反应体系。对50头母牛和30头公牛DNA样品的检测表明,母牛只能扩增出558 bp的HBB基因片段,而公牛则可以扩增出558 bp的HBB基因片段和219 bp的SRY基因片段,其鉴定结果与实际性别一致。同时,以微量的卵母细胞和精子细胞为模板对该反应体系的灵敏性进行了检验,结果表明,该反应体系可对10个细胞水平进行准确鉴定。

【目的】建立可准确鉴定猪胚胎性别、可靠的巢式PCR反应体系及研究卵胞浆内单精子显微注射技术(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)对胚胎性别的影响。【方法】根据猪X染色体和Y染色体上牙釉质基因(Amelogenin gene,AMEL)第三内含子上9～10 bp的缺失设计了巢式PCR引物,并利用10个猪耳组织基因组DNA样品优化了PCR扩增条件,巢式PCR—荧光标记的半自动基因组扫描技术鉴定205个猪ICSI早期囊胚性别。【结果】特异性扩增了199个ICSI样品,6个ICSI胚胎扩增失败。经PCR产物片段扫描,只在178～179 bp处有峰的,判定为雌性胚胎,在169～171和178～179 bp 2处有峰则判定为雄性胚胎。共确定雄性胚胎71个,雌性胚胎128个,其中公母比例1∶1.8。【结论】基于牙釉质基因的巢式PCR方法可用于猪胚胎性别鉴定。性别比例偏离在一定程度上说明在ICSI囊胚中存在部分孤雌胚胎。

【目的】建立鉴定鸡(♂)与鹌鹑(♀)属间杂交早期胚胎性别的方法,检验早期胚胎性别比。【方法】人工授精获得鸡与鹌鹑杂交种蛋,按照鸡的标准孵化条件同批入孵,连续随机采集发育早期66、72、78、84、90、96、102、108、114、120h活胚。采用RT-PCR方法,以已知性别的鹌鹑作外参照,β-actin引物作内参照,用鹌鹑Wpkci基因保守区设计的引物鉴定早期胚胎样本性别。【结果】Wpkci引物可以准确鉴定杂交胚胎的性别;早期胚胎性比率与理论值相比,差异极显著(P0.05)。【结论】利用Wpkci引物建立了一种简单、快速、可...

【目的】研究父源印记基因在牛早期胚胎中的表达模式。【方法】利用Real-time PCR技术,检测Gnas、Grb10和Xist这3个父源性印记基因在牛体外受精(In vitro Fertilization,IVF)和孤雌激活(Parthenogenetic Activation,PA)胚胎各发育阶段的表达情况。【结果】对于IVF和PA两种来源的牛胚胎,Gnas在胚胎各发育阶段的表达没有明显差异;Grb10在2细胞阶段的PA胚胎中的表达量明显高于在IVF胚胎的,但从4细胞阶段到囊胚阶段,Grb10在两种来源的牛胚胎中表达没有明显差异;从2细胞阶段到8细胞阶段,Xist在两种来源的牛胚胎中表达没...

【目的】明确牦牛早期胚胎发育过程中核旁斑点形成的关键时期，确定其参与形成长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNAs)，探索核旁斑点形成对后续胚胎发育能力的影响及调控机制。【方法】体外受精生产牦牛胚胎，DAPI染色标记结合核旁斑点结构蛋白1(paraspeckle Protein 1,PSPC1)mRNA实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测确定牦牛早期胚胎发育核旁斑点形成关键时期，免疫荧光技术验证胚胎PSPC1蛋白表达水平；qRT-PCR检测核旁斑点形成相关LncRNAs核旁斑点组装转录因子1(encoding nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1)、共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1(coactivator associated arginine methyltransferase 1,CARM1)及54 kD核结合蛋白（non-POU domain containing octamer-binding protein,p54nrb）mRNA在各时期胚胎中表达水平；RNA干扰技术抑制合子PSPC1 mRNA水平，比较后续各阶段胚胎发育率，通过分析囊胚细胞总数、滋养层细胞数（trophoblast cells,TE）、内细胞团数（inner cell mass,ICM）评估囊胚质量；检测对照组和PSPC1 mRNA干扰组囊胚中B-细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因（B-celllymphoma/leukemia-2,Bcl-2）和B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x(B-cell lymphoma/leukemia associatedx protein,Bax)表达水平。【结果】（1）在不同发育阶段胚胎细胞的细胞核均可观察到核旁斑点，但2-细胞和4-细胞时期胚胎细胞核中核旁斑点更为清晰，2-细胞至桑椹胚阶段PSPC1 mRNA呈现高水平表达，其中4-细胞到桑椹胚阶段PSPC1 mRNA水平最高，PSPC1蛋白荧光强度在此阶段最强。（2）NEAT1、CARM1及p54nrb mRNA均在2-细胞到桑椹胚阶段呈现高水平表达，其中NEAT1和p54nrb在4细胞时期水平最高，CARM1在2-细胞到桑椹胚3个阶段表达水平差异不显著（P>0.05）。（3）PSPC1 mRNA干扰组桑椹胚与囊胚发育率均显著降低，且桑椹胚发育率降低幅度高于囊胚，PSPC1 mRNA干扰组囊胚细胞总数显著低于对照组，其中以ICM细胞数降低为主，TE细胞数在两组之间差异不显著。（4）PSPC1 mRNA干扰处理组囊胚中促细胞凋亡因子Bax mRNA和蛋白均显著增加，抑凋亡相关因子Bcl-2 mRNA和蛋白降低，且囊胚中内细胞团发生裂解。【结论】牦牛早期胚胎发育核旁斑点形成的关键时期为2-细胞至桑椹胚阶段，其中主要集中在4-细胞时期，且PSPC1、NEAT1、CRAM1、p54nrb在核旁斑点形成时期呈高水平表达。干扰牦牛合子PSPC1 mRNA导致后续胚胎发育能力降低，并通过诱导ICM凋亡降低囊胚质量，影响囊胚中细胞命运决定。

将体外受精后的牛卵母细胞随机分组进行培养,比较了胎牛血清(FBS)和发情后7 d牛血清(E 7BS)、不同培养液(CR 1+3 m g/mL BSA、SOF+3 m g/mL BSA和SOF+0.1 m g/mL PVA)、共培养体系和不同培养液体积(0.1,0.5和2.0 mL)对胚胎发育的影响,优化了牛胚胎体外培养体系,并对该体系的稳定性进行了检验。结果表明,优化后的牛胚胎培养体系为:前48 h用CR 1+3 m g/mL BSA培养液,48 h后用CR 1+体积分数10%E 7BS培养液培养120 h,培养液体积为0.5 mL,并且采用共培养,受精后颗粒细胞保留48 h。用该培养体系培养...

胚胎发育涉及一系列复杂的生理学、细胞生物学以及基因组学过程。已有研究表明，胚胎发育早期特别是原肠胚和神经胚时期存在着一定强度的内源生理电场，当存在类似内源生理电场强度的外源电场时，能引导细胞迁移、控制细胞极化、调节细胞增殖和分化，从而在一定程度上影响胚胎发育。本研究主要就内源生理及外源电场对胚胎发育的引导或干扰作用进行综述，以期为胚胎发育研究提供新思路。

　在TCM-199中添加一些确定的辅助成分,探讨在无血清培养基中添加不同浓度HA对牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎体外发育的影响。结果表明,在卵母细胞成熟培养液(TCM-199-m)中添加4.0mg/mL的HA时,卵母细胞的成熟率和卵裂率与对照组(BSA)无显著差异(P>0.05),分别为85.14%,83.57%和89.47%,85.24%,但显著高于其他各浓度组(P0.05),分别为27.64%和26.51%,但显著高于TCM-199-...

在多年对日本鳗鲡人工育苗技术研究的基础上,通过采用对胚胎和早期仔鱼的活体观察、计算机图文分析以及组织切片等方法,系统研究了鳗鲡胚胎及孵化后19d前仔鱼的生物学特性。研究结果表明,在水温(23±0.5)℃条件下,日本鳗鲡从受精卵到仔鱼出膜需约38h30min,总积温为885.50℃·h。其特征与一般硬骨鱼类胚胎发育基本相同,鳗鲡胚胎发育可分为14期,为典型的盘状卵裂,原肠作用通过细胞的下包和内卷完成。但日本鳗鲡早期仔鱼与一般硬骨鱼类的仔鱼存在较大差异,表现为无色透明的血细胞和S形心管;开放型的口腔,发达且不能闭合的上下颌和3对颌齿;孵化后3～9d在身体两侧出现由神经细胞和支持细胞构成发达的感觉丘...

以屠宰场牛卵巢为材料,采用体外成熟、体外受精、早期胚胎的体外培养等方法,研究了牛卵泡液(BFF)浓度、颗粒细胞单层(GCM)和培养微滴大小对牛卵母细胞体外发育潜力的影响。结果表明:(1)与未添加BFF的对照组相比,成熟培养液中分别加入10%,20%和40%的混合BFF,均可明显促进卵母细胞受精后的发育(P0.05);但添加GCM的2级、3级卵母细胞受精后的卵裂率、6~8细胞发育率和囊胚率分别显著高于未添加组...

研究了牛体外受精后早期胚胎体外发育时,向其基础培养液中加入牛磺酸对胚胎桑椹胚率、囊胚率和孵化囊胚率的影响,以探寻牛磺酸克服牛胚胎"体外发育阻滞"现象的作用。试验结果表明:以TCM-199+10%FBS为基础培养液(对照组),再加入7,14mM的牛磺酸(试验组),试验组与对照组的桑椹胚率分别为48.1%、47.4%和43.2%;囊胚率分别为26.4%、22.3%和21.0%;孵化囊胚率分别为21.8%、18.7%和0%。IVF后2细胞、4～8细胞及8～16细胞期,在基础培养液中分别添加7mM的牛磺酸时,桑椹胚率分别为48.7%、57.1%和52.0%,囊胚率分别为25.1%、30.7%和27.9...