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[期刊] 中国农业科学
[作者]
吴彤 刘旭 李佳禾 闫新博 张宁 吴文学
【目的】牛支原体（ＭｙｃｏｐｌａｓＭａ ｂｏｖｉｓ）是导致牛多种疾病综合征的病原体之一，在世界范围广泛流行。为了有效监测此病在中国的流行情况，迫切需要敏感、便捷的诊断试剂产品。【方法】通过构建含有牛支原体ｕｖｒｃ基因片段的重组质粒并转化Ｔｏｐ１０感受态细胞，获得重组大肠杆菌ｒｐ－ｕｖｒｃ。重组大肠杆菌大量表达并提取重组质粒后，获得质粒浓度为１０～４拷贝／μｌ的溶液，作为质控用阳性对照品。根据文献报道的浓度配制甜菜碱溶液和显色液（主成份为ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ ｉ和Ｈｎｂ），分别作为冻干品溶解用溶液和等温扩增产物显色溶液。在已建立的牛支原体环介导等温扩增（ｌｏｏｐ－ＭｅｄｉａＴｅｄ ｉｓｏＴＨｅｒ．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王一凡 乔春艳 刘永峰
[目的]提高牛奶中牛DNA的分离提取效率,建立稳定的牛奶中牛DNA提取的试剂盒法。[方法]以从牧场中采集的新鲜牛奶为材料,在前期建立的牛奶中牛DNA提取方法基础上,针对消化温度(55,60,65℃)、消化时间(10,60,120,180,240 min)、质量分数20%十二烷基硫酸钠(SDS)裂解液用量(20,35,50,65,80μL)、20mg/mL蛋白酶K用量(0,10,30,50,70μL)等重要参数依次进行优化,通过DNA品质测定筛选最佳的DNA提取条件,建立稳定的牛奶中牛DNA提取的试剂盒方法,并用深加工的奶粉和高低温液态奶制品对试剂盒方法进行验证。[结果]不同消化温度和消化时间从牛奶中提取的总DNA、线粒体DNA(mtDNA)和核DNA(nDNA)的完整性均表现良好,但不同消化温度和消化时间的DNA质量浓度和纯度存在差异,在消化温度为60℃、消化时间为10 min、SDS裂解液用量为50μL、蛋白酶K用量为50μL时,提取的DNA品质较优,是最佳的DNA提取条件,该条件下DNA平均质量浓度为97 ng/μL,平均纯度为1.44。对优化指标后建立的试剂盒方法进行验证,结果表明该方法不仅适用于生鲜牛奶,而且还适用于液态和固态奶制品。[结论]在所获得的最佳DNA提取条件下,牛奶体细胞裂解充分、完全,所提DNA质量浓度和纯度较高,完整性较好,PCR扩增性能较强。建立的牛奶中牛DNA提取试剂盒法适用范围较广。
关键词：
牛奶 DNA提取 提取条件优化 试剂盒法
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
庞建虎 乔龙亮 朱鹏 高威芳 章礼萍
有别于费力和费时的传统病原体检测方法,基于靶基因的分子生物学检测方法以其快速和灵敏的特点逐渐成为现代水产病原体检测的首选.在众多分子生物学检测方法中,尤以核酸等温扩增技术备受关注.本文对各种核酸等温扩增技术在水产病原体检测中的应用进行了综述,阐述了各种核酸等温扩增技术的原理,对比分析了各种核酸等温扩增技术的优劣,介绍了该技术在水产病原体检测中的应用现状,展望了该技术的发展趋势,旨在促进我国水产病原体现场快速检测技术的发展.
关键词：
核酸等温扩增 水产病原体 快速检测
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张从钺 周红 蔺辉星 范红结
【目的】研制一种检测胞内劳森菌（Lawsonia intracellularis,LI）抗体的间接ELISA试剂盒，为LI的监测和疫苗评价提供工具。【方法】表达并纯化LI的外膜蛋白Omp2，以其为包被抗原建立检测LI抗体的间接ELISA方法，优化ELISA反应条件；用建立的ELISA方法检测稀释的LI阳性血清来评价试剂盒的敏感性，检测其他病原的阳性血清来评价试剂盒的特异性；试制3批试剂盒，制定试剂盒的敏感性和特异性检验标准，测定试剂盒在4℃的保存期；用试制的试剂盒检测LI阴性和阳性质控血清，研究试剂盒的成立条件；通过对不同时间和猪场采集的1 000份临床猪血清样本的检测来评价该试剂盒的实用性；用本试剂盒与进口商品化试剂盒平行检测LI阳性和阴性血清各50份以评价试剂盒的符合率。【结果】成功表达并纯化了Omp2蛋白，蛋白纯度为90.31%，在Western blot试验中可以与LI阳性血清发生反应。ELISA最佳反应条件为：Omp2以200 ng/孔4℃包被12-16 h；血清1﹕50稀释，37℃孵育30 min；羊抗猪Ig G-HRP 1﹕20 000稀释，37℃孵育30 min;TMB底物37℃显色15 min，用0.5 mol·L-1的硫酸终止反应。该试剂盒检测LI阳性血清的最高检出倍数为8，敏感性较好；试剂盒检测E.coli、App、Mhp、SS2、PRRSV、PRV的结果均为阴性，特异性较好。制定了试剂盒的敏感性和特异性检验标准。试剂盒在4℃可保存15个月。试剂盒的成立条件为：阳性标准血清OD450nm≥1.25，阴性标准血清OD450nm<0.3。试制的试剂盒批内、批间重复性试验变异系数均小于10%。与国外商品化ELISA检测试剂盒对比的符合率达86%。用试制的ELISA试剂盒检测1 000份华东部分地区临床猪血清样品，其中LI阳性检出率为59.90%，表明LI在华东地区猪群中普遍存在。【结论】本研究开发的LI间接ELISA抗体检测试剂盒特异性高，灵敏度高，与商品试剂盒符合率高，可用于临床LI抗体的检测。
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈春花 李喜仙 阎玉河 邓瑞广
用旋毛虫基因重组抗原 (TSRA)建立了诊断猪旋毛虫病的快速ELISA诊断试剂盒。用TSRA和旋毛虫肌幼虫排泄 -分泌抗原 (ES)分别对 12份人工感染旋毛虫病猪血清进行快速ELISA检测 ,阳性率为 10 0 %。在猪旋毛虫病发病区随机采集 10 3份血清和肉样 ,分别用TSRA和ES作抗原对血清进行快速ELISA检测 ,结果显示 ,它们与肌肉消化法的诊断符合率分别为95 12 %和 96 3%。研究证明 ,用TSRA组装的诊断试剂盒具有良好的灵敏性、特异性和重复性。
关键词：
猪旋毛虫病 重组抗原 ELISA试剂盒
[期刊] 中国农业科学
[作者]
邢广旭 王国栋 胡骁飞 王方雨 邓瑞广 张改平
【目的】建立诺氟沙星(norfloxacin,Nor)免疫检测试剂盒。【方法】基于所制备的诺氟沙星单克隆抗体,通过矩阵法筛选最佳抗体工作浓度和二抗工作浓度,建立诺氟沙星间接竞争ELISA试剂盒(Nor-kit),并对其性能进行了鉴定和确证。【结果】Nor-kit的平均IC50为5.18μg.L-1,灵敏度为0.31μg.L-1,检测限为1.00μg.L-1。试剂盒除了和诺氟沙星反应外,还和同系物中的培氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星及恶喹酸有不同程度的交叉反应。奶样中回收率平均为103.23%,变异系数(CV)为9.33%。3个不同批次试剂盒的测定结果中,批内变异系数小于10%,且批间变异...
关键词：
诺氟沙星 单克隆抗体 ELISA 试剂盒
[期刊] 淡水渔业
[作者]
陈静仪 郑荣华 柯毅龙 李贤明 林园
近年我们研制成一种可用于水产养殖水体中NH_4~+及NO_2~-浓度快速测定的试剂盒,对常规的比色法作了重要改进,使其成为可用于现场测定,并适用于淡、海水,测定范围0—10mgNH_4~+/L和1—1.0mg-NO_2~-/L。两种试剂盒测定结果与标准方法(GB7479-89;GB7493-87)的结果一对,相对标准偏差≤23％;能满足现场测定的要求。本试剂盒体积小(150×110×50mm~3),重量轻(约250克),每盒可作150次测定,每次测定仅须2—3分钟,操作简便,普通养殖人员可自行测定。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张鹏云 陈敏 刘明星 周红 蔺辉星 范红结
【背景】副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪的上呼吸道病原菌，引起格拉瑟氏病，主要引起断奶前后和保育阶段的猪发病，通常见于5—8周龄的青年猪，发病率一般为10%—15%。该菌有15种血清型，目前主要养猪国家流行的血清型为4型、5型、12型和13型，是严重危害养猪业发展的主要细菌性病原之一。目前国内还没有检测该菌抗体的商品化试剂盒。【目的】研制一种针对副猪嗜血杆菌的快速、敏感和特异性强的抗体检测试剂盒，为格拉瑟氏病的有效防控提供技术支持。【方法】表达并纯化OppA、DppA、HbpA 3种不同的副猪嗜血杆菌ABC转运体周质底物结合蛋白，使用副猪嗜血杆菌阴、阳性参考血清筛选以上3种蛋白中免疫反应性和反应特异性好的蛋白。以筛选的蛋白为包被抗原，建立检测HPS抗体的间接ELISA方法，优化间接ELISA反应条件，并组装试剂盒。在此基础上，确定该试剂盒的敏感性、特异性；通过对不同时间、不同猪场采集的2 000份临床猪血清样本进行检测，评价该试剂盒的实用性；在以上临床血清样本中随机选取200份，分别以研制的试剂盒、间接血凝试验以及进口商品化试剂盒进行检测，比较检测结果，验证该试剂盒的符合率；最后，使用研制的试剂盒检测免疫和攻毒猪采集的血清，评价该菌免疫后的抗体消长规律。【结果】成功表达并纯化了OppA、DppA、HbpA 3种蛋白，发现OppA免疫反应性和反应特异性最好。经过反应条件优化，确定OppA包被浓度为1μg·mL-1，封闭液为0.5%的BSA-PBS溶液，样品稀释液为1%的BSA-PBST溶液，样品孵育时间为30min，样品稀释度为1:50，酶标二抗孵育时间为3 0min，底物作用时间为15 min，临界值为0.18；试剂盒的敏感性和特异性为96.67%，能与国内常见血清型HPS阳性血清反应而不与猪其他常见病原阳性血清发生交叉反应；2 000份临床血清样本阳性检出率为34.65%；随机抽取200份血清样本，与间接血凝试验的符合率为92.50%，与进口商品化试剂盒符合率为87.00%，符合率较高；使用试剂盒检测免疫和攻毒后不同时间采集的猪血清，HPS抗体消长规律符合预期。【结论】研制的副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒特异性高、敏感性强，与商品化试剂盒和间接血凝试验的符合率高，可用于临床HPS抗体检测和疫苗免疫效果评价。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
张雪寒 张强 张碧成 汪伟 倪艳秀 温立斌 李彬 周俊明 何孔旺 周萍
本研究旨在研制一种以紧密素为检测靶标的间接ＥＬＩＳＡ技术，检测血清中产志贺毒素大肠杆菌（ＳｈＩｇＡ ｔｏｘＩｇＥｎＩｃ ＥＳｃｈＥｒＩｃｈＩＡ ｃｏＬＩ，ＳｔＥｃ）的抗体水平。根据紧密素２７个亚型的ｎ端保守序列，体外表达３９０～５４３ ＡＡ片段制备包被抗原，通过敏感性、特异性、重复性和稳定性实验，建立检测ＳｔＥｃ的抗体的间接ＥＩＩＳＡ方法。经优化筛选的间接ＥＬＩＳＡ最佳反应条件：抗原包被浓度３ ｎｇ／孔，待检血清稀释比例１∶２００，ｈｒＰ－兔抗羊Ｉｇ ｇ、ｈｒＰ－兔抗牛Ｉｇ ｇ的工作浓度均为１∶１５０００，５％脱脂奶封闭Ｌ ｈ，底物作用时间１０ｍＩｎ，用于牛、羊疫苗抗体检测或者ＳｔＥｃ大肠杆菌．．．
关键词：
致病性大肠杆菌 紧密素 间接ELISA
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵银丽 王建华 王自良 滕蔓 刘庆堂 邓瑞广 范国英 张改平
【目的】研制快速、灵敏、特异的恩诺沙星残留检测ciELISA试剂盒(ENR-Kit),为动物源性食品中恩诺沙星(ENR)残留的快速免疫学检测奠定基础。【方法】通过细胞融合技术制备恩诺沙星单克隆抗体(ENR mAb)杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法生产ENR单抗,应用ENR mAb研制ENR残留间接竞争ELISA(ciELISA)快速检测试剂盒,并对其灵敏度、半数抑制浓度(IC50)、特异性、准确度和基质效应性进行检测。【结果】筛选出2株杂交瘤细胞,其单抗亚类均为IgG1亚型。4G1-B3杂交瘤细胞株的ENR mAb间接ELISA效价为1∶1.024×106,亲和常数(Ka)为9×1010L/moL...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
邱军强 王建平 吕利群 孙琪 乐韵
通过增菌液的筛选、光谱性细菌固体培养基的筛选、药物的筛选、诊断准确率的比对、重复性试验等一系列试验,初步组建了一种可用于淡水养殖过程中细菌性疾病快速选药试剂盒。在部分养殖区域测试后发现,该试剂盒质量稳定,操作简便,结果可靠,适用于基层人员防治淡水养殖过程中细菌性疾病。
关键词：
细菌性疾病 快速选药 淡水养殖 试剂盒
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
李英瑕 徐婷婷 刘爽 万晓媛 张庆利
近年来，虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei， EHP)流行使我国养殖对虾遭受严重经济损失，现场快速检测是EHP防控的重要技术保证。本研究对本实验室研发的EHP现场快速检测试剂盒的分析特异性(ASp)、分析灵敏度(ASe)、诊断特异性(DSp)、诊断灵敏度(DSe)、重复性和稳定性6项性能参数开展了系统评估。ASp的测试显示，该试剂盒与对虾白斑综合征病毒(WSSV)、偷死野田村病毒(CMNV)、虾血细胞虹彩病毒(SHIV)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(Vp_(AHPND))、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)等5种对虾常见病原及健康对虾无交叉反应；ASe测试显示，该试剂盒检测下限为10~(1)copies/反应；以EHP TaqMan RT-qPCR方法为标准，比较了试剂盒对298份临床样品的测试结果，试剂盒的DSp为99.2%、DSe为91.7%；试剂盒对EHP阴性样品及强阳性样品的检测重复率为100%，弱阳性样品检测重复率为95.8%；试剂盒在–20℃和–40℃条件下分别可保存7个月和12个月以上。本研究表明，本实验室研制的EHP现场快速检测试剂盒具操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好和稳定性强等优点，可满足对虾养殖现场对EHP的高灵敏度检测。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李小玲 刘斌 但现龙 王大鹏 周敏 史贤明
【目的】研制一种能有效指示假阴性的PCR检测产品,用于沙门氏菌快速、准确、灵敏的检测。【方法】针对沙门氏菌invA基因、stn基因序列分别设计引物与扩增内标,建立添加扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法,组装试剂盒,并对试剂盒的各项性能进行评价。【结果】试剂盒对147株沙门氏菌和28株非沙门氏菌的检测结果显示,所有沙门氏菌均能扩增出362 bp的目标条带,非沙门氏菌仅扩增出520 bp的内标条带。试剂盒检测沙门氏菌基因组DNA的检测限为8.0 fg/PCR,检测染菌量为4—5 CFU/10 mL的牛奶样品,增菌8—10 h即得到阳性结果。反复冻融60次或-20℃下贮存1年,均不影响试剂盒的使用效果...
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
魏松红 东琴 逄若霖 王凯莉 芈越瑶 张彤
在制备多克隆抗体的基础上,研制用于检测莠去津残留的间接竞争ELISA试剂盒。结果表明:莠去津抑制率回归曲线为y=19.762x+5.6026,相关系数R2=0.981,线性检测范围为1~5000μg·L-1,最低检测限为5.35μg·L-1,IC50为176.44μg·L-1。莠去津多克隆抗体的交叉反应率小于20%,莠去津试剂盒的添加回收率均高于75%,供试样品检测结果的批内和批间变异系数均低于10%。试剂盒在4℃或-20℃下贮存270d仍有效。
关键词：
莠去津 残留 酶联免疫吸附分析 试剂盒
[期刊] 中国农业科学
[作者]
杨继飞 杨苏珍 杨艳艳 职爱民 赵东 郅玉宝 邢广旭 邓瑞广 柴书军 张改平
【目的】建立合成多肽抗原检测FMD NSP抗体的ELISA方法。【方法】固相法合成特异性FMDV NSP B细胞表位肽,将其偶联在BSA载体蛋白上,作为抗原包被在ELISA板上,制备检测抗FMDV NSP抗体的ELISA试剂盒,并对该试剂盒进行方法考核。【结果】抗原包被浓度选择2.5μg·mL-1;检测199份血清标本,与美国UBI商品试剂盒符合率达到96.48%,与国产3ABC ELISA比较,符合率为97.48%,显示极好的一致性。【结论】该合成肽ELISA试剂盒可以用以检测NSP抗体,从而鉴别FMD的自然感染与疫苗免疫,试剂盒特异性强,重复性好、稳定性高,操作简便。
关键词：
FMDV ELISA 合成肽
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