[目的]本研究旨在构建PCDNA3.1(-)-bPAG1重组表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞细胞中转染表达。[方法]通过基因优化和PCR法扩增得到bPAG1的全基因序列,经T_4连接酶将载体PCDNA3.1(-)与酶切bPAG1片段连接,构建PCDNA3.1(-)-bPAG1重组载体后转染到CHO细胞,经SDS-PAGE和Western Blot检测重组牛妊娠相关糖蛋白1(rbPAG1)的表达效果。[结果]PCR扩增得到1218 bp的bPAG1基因片段,构建的重组质粒PCDNA3.1(-)-bPAG1经双酶切获得约5400和1218 bp的2条片段,与预期相符;对重组载体测序,与优化后的基因序列完全一致;SDS-PAGE和Western Blot鉴定显示,获得相对分子质量约为62 kDa的bPAG1重组蛋白,通过Ni柱亲和层析纯化后,rbPAG1纯度可达88%。[结论]本研究为bPAG抗体的制备和奶牛早孕诊断技术的研发奠定了基础。

利用RT-PCR技术,将狂犬病病毒株ERA株糖蛋白胞外区基因分两段进行扩增,经克隆与序列分析,两片段大小分别为523,381 bp,各编码174,127个氨基酸,分子量分别为19.7,14.5 kDa。在原核表达载体pET-43a中分别克隆了这两段糖蛋白基因,将重组质粒转化到表达菌BL21(DE3)中,经SDS-PAGE电泳分析,在分子量约为94,89kDa处分别出现新蛋白带,和预期的目的蛋白的分子量相符。两重组蛋白主要以可溶形式表达,利用Ni2+亲和层析柱纯化了蛋白,纯度大于95%。Western-Blot分析结果显示,两种重组融合蛋白均可与兔抗RBV多抗血清反应,具有良好的反应原性。

为了进一步在蛋白质水平对人白细胞抗原HLA-G进行分析,利用已经构建好的克隆质粒pGEM-T-HLA-G1,进一步构建了重组原核表达质粒pET28a-sHLA-G1。SDS-PAGE检测表明,重组蛋白sHLA-G1在大肠杆菌(E.coli)中得到稳定表达,原核表达的重组蛋白sHLA-G1主要以包涵体形式存在。包涵体蛋白经充分洗涤、尿素溶解后用钴离子树脂纯化,并用SDS-PAGE和Western印迹进行了分析,鉴定结果表明,该蛋白纯度达到90%以上,并能与HLA-G特异性抗体87G反应。该研究结果为进一步的复性工作奠定了基础。

【目的】对康氏木霉HEX1蛋白进行原核表达和纯化,为进行抗体制备及深入研究HEX1功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增康氏木霉hex1基因,构建pMD19-T-hex1重组克隆质粒,在此基础上构建pET28a-hex1表达载体,转化E.coli BL21(DE3)细胞。通过IPTG诱导表达,对重组HEX1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定。【结果】成功克隆了长660bp的hex1基因并构建了融合表达载体,HEX1蛋白在IPTG诱导下得到表达。融合蛋白主要以包涵体形式存在,能与抗His标签的兔多克隆抗体发生特异性反应,并纯化出了融合表达蛋白。【结论】康氏木霉HEX1蛋白在原核细胞中得到成功...

为表达和纯化尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)cyp19a1a蛋白,本研究从尼罗罗非鱼卵巢提取总RNA,反转录获得cDNA模板后,利用设计的引物PCR扩增cyp19a1a ORF区1200 bp片段,双酶切后连接到pET-28a(+)表达载体上,经酶切验证和DNA测序鉴定,证明成功构建了pET-28a-cyp19a1a原核表达载体。将表达载体转化到大肠杆菌(E.coli)BL21中,优化IPTG诱导浓度和诱导时间。结果显示,在0.5 mmol/L IPTG诱导8 h后,cyp19a1a重组蛋白大量表达,并以包涵体形式存在。通过Ni2+-NTA层析柱和切胶纯化,获得与预期片...

根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增得到完整的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a和pET32a上,构建出重组表达质粒pET28a-NS1和pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到NS1融合蛋白(His-NS1),其分子质量约分别为44,58 kDa,均在诱导后6 h达到表达量高峰。分析显示,2种融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于鹅坦布苏病毒NS1蛋白的研究奠定了基础。

以pGEX–KG为骨架,运用分子克隆方法构建了生长素结合蛋白AtTIR1和IAA28的原核表达载体,通过转化不同表达菌株探索了2种蛋白的诱导表达条件。结果表明:在0.4 mmol/L IPTG诱导下,GST–IAA28融合蛋白在表达菌株Tuner中的表达量最高,其适宜诱导温度为16℃;在0.6 mmol/L IPTG诱导下,BL21(DE3)中GST–IAA28的表达量最高;在各种浓度的IPTG诱导下,Rosetta中的GST–IAA28的产量均不高;在25℃和0.4mmol/L IPTG诱导条件下,Rosetta中的GST–AtTIR1表达总量最高,每克细菌可诱导出约0.2 mg的目标蛋白,...

通过分析半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Dmrt1重组蛋白注射卵巢后基因表达调控,探讨Dmrt1在半滑舌鳎性别决定与分化中的功能。实验利用原核表达系统(Pet-32a)对半滑舌鳎Dmrt1基因进行重组表达,并通过亲和层析纯化获得了重组目的蛋白(Pet-32-dmrt1)。重组蛋白注射卵巢后实时定量PCR分析结果显示,Cyp19a和Foxl2在6~24 h内两基因表达量均显著下调,Sox9a基因表达量在6~24 h内有显著上调,但48 h后3个基因的表达量逐渐恢复正常表达水平。研究结果证实,Dmrt1重组蛋白具有生物活性,且对性别相关基因表达调控具有一定的影响,在性别决定...

【目的】体外真核表达梅花鹿(Cervus nippon)激活素A重组蛋白并测定其生物活性,为进一步明确激活素A在梅花鹿卵母细胞体外成熟过程中的生理学功能提供基础。【方法】利用RT-PCR技术克隆梅花鹿激活素βA (ActivinβA, ACTBA)亚基基因的cDNA全长序列,同时利用生物信息学对梅花鹿激活素βA的基因特征进行分析。在NCBI数据库下载其他物种激活素βA同源序列,利用Clustalx和MEGA 4软件进行同源比对并构建进化树。构建pcDNA4/ACTBA重组质粒并转染至CHO细胞内,进行目的蛋白的体外表达。采用免疫荧光及Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱对蛋白产物进行纯化。采用Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中的SMAD2和SMAD3的磷酸化水平。最后采用荧光定量PCR及Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中类固醇激素合成相关酶的表达量。【结果】克隆得到的梅花鹿ACTBA亚基基因含有1 278 bp的碱基,编码426个氨基酸。同源性比较发现梅花鹿ACTBA基因与牛的ACTBA基因同源性最高达98.4%同源。进化分析表明该基因与同为偶蹄目动物的反刍兽牛和山羊亲缘关系最为接近。经酶切、PCR和测序方法鉴定,成功构建真核表达质粒pcDNA4/ACTBA。免疫荧光显示该质粒在CHO细胞中主要定位在细胞质。Western blot结果显示激活素A的前体蛋白分子量约为58 kD左右。镍亲和层析纯化后的激活素A重组蛋白显著增加SMAD2和SMAD3的磷酸化,表明激活素A可以激活SMAD信号通路。同时成熟的激活素A重组蛋白可以诱导猪颗粒细胞芳香化酶(Aromatase)蛋白表达量上调,类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)表达量下调,FSH受体基因表达量升高,LH受体基因表达量降低,但胆固醇侧链裂解酶(Cholesterolside-chaincleavageenzyme,CYP11A1orP450scc)及3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-Hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)基因表达量不变。结果表明梅花鹿激活素A重组蛋白可以增强FSH对颗粒细胞的生物学作用,也可以减弱LH对颗粒细胞的生物学作用。【结论】成功构建了激活素A蛋白的真核表达载体,并获得了较高纯度的、具有生物学活性的梅花鹿激活素A重组蛋白,为下一步激活素A蛋白的生物学功能和生理学机制研究奠定了基础。

为研究海带核基因组编码的nuc Cbb X蛋白的结构和功能,根据海带配子体核基因cbb X(Gen Bank登录号:NP_053838)设计含有酶切位点的引物,通过RT-PCR方法获得末端连接NdeⅠ、XhoⅠ酶切位点的完整ORF。序列保守性分析表明,预测的海带成熟nuc Cbb X蛋白序列含具有AAA+结构域、Walker-A和Walker-B ATP结合位点及ATP水解酶和Ru Bis Co活化酶活性相关位点。序列相似度分析表明,海带nuc Cbb X与其质体基因组编码的pt Cbb X和类球红细菌的Rs Cbb X蛋白氨基酸序列相似度均较低,分别为37.4%和36.8%,相比pt Cbb...

为研究耐铜植物海州香薷的金属硫蛋白(EhMT1)的结构与功能,运用分子生物学方法构建了pGEX-2T-EhMT1重组表达载体,经转化大肠杆菌BL21(DE3)后表达得到大小为33×103左右的融合蛋白GST-EhMT1,与预期结果一致。对融合蛋白诱导表达的温度、时间、IPTG诱导浓度等条件进行了优化,成功构建了能大量表达可溶性GST-EhMT1的优良原核表达体系。诱导表达的融合蛋白经GST-Sepharose亲和层析纯化后,每升菌液获得的可溶性融合蛋白高达70mg。用纯化的融合蛋白免疫新西兰雄兔,制备的抗血清经间接ELISA检测到较高的多克隆抗体效价。蛋白质印迹结果显示,纯化的蛋白质与兔抗血清...

根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF3基因序列,利用Primer 5.0软件设计合成了1对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为765 bp的片段,并将扩增的片段插入pTG19-T载体进行测序而获得含有ORF3的阳性克隆pTG19-T-GP3。将此基因亚克隆到原核表达载体pET-32a,经筛选获得了阳性重组质粒pET-GP3,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为45 kDa的融合蛋白GP3-His,纯化后经Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。从而为进一步研究PRRSV次要结构蛋白GP3的免疫...

mTOR信号通路在真核细胞代谢调控中发挥着关键的调控作用,该通路核心元件mTORC1复合物的活性受其上游TSC复合物负调控,TSC复合物包括TSC1、TSC2、TBC1D7三种蛋白.以TBC1D7蛋白为研究对象,通过氨基酸序列比对显示多物种来源的TBC1D7蛋白具有较高的保守性,且蛋白三维结构分析证实其分子表面存在高度保守区域.随后,构建了人类TBC1D7蛋白原核表达载体并在大肠杆菌中表达得到全长TBC1D7蛋白,经过酶切去除标签和凝胶排阻层析得到了高纯度TBC1D7蛋白.另一方面,通过在HCM细胞中对TBC1D7进行敲降和过表达,证实了TBC1D7的表达会直接升高mTORC1的活性;反之,升高TBC1D7的表达则会抑制mTORC1的活性.本研究表达和纯化了人类TBC1D7蛋白,并探讨了在人类心肌细胞中TBC1D7的表达与其下游mTOR信号通路之间的联系,为人类TBC1D7蛋白和mTOR信号通路的进一步研究打下了良好基础.

[目的]本文旨在通过建立棉铃虫效应蛋白HARP1体外表达纯化体系，对HARP1蛋白进行体外表达和纯化，为解析HARP1蛋白与植物茉莉酸信号途径中JAZ蛋白的互作分子机制奠定基础。[方法]对harp1基因序列进行密码子优化，使用蛋白预测软件预测HARP1中的信号肽和成熟肽。基于以上信息构建目的蛋白的表达质粒并进行诱导表达，使用亲和层析、酶切、透析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对目的蛋白进行纯化，使用SDS-PAGE和Western blot对蛋白进行分析和检测。[结果]通过优化将harp1基因密码子适应度值(CAI)从0.39提升到0.95。蛋白预测软件预测N末端21个氨基酸为信号肽，信号肽与成熟肽切割位点在第21位丙氨酸和第22位亮氨酸之间，成熟肽为第22位亮氨酸至第122位精氨酸。构建表达质粒pETDuet1-His6-MBP-3C-HARP1(22～122),IPTG能够诱导目的蛋白表达，使用Ni-NTA柱纯化出融合蛋白His6-MBP-3C-HARP1(22～122),3C蛋白酶能够切除His6-MBP标签，使用阴离子交换柱成功分离His6-MBP标签和HARP1(22～122)蛋白，使用Superdex 200 increase Gel Filtration Column进一步纯化获得单体HARP1(22～122)蛋白。[结论]成功建立HARP1蛋白体外表达与纯化体系。

[目的]本文旨在通过建立棉铃虫效应蛋白HARP1体外表达纯化体系，对HARP1蛋白进行体外表达和纯化，为解析HARP1蛋白与植物茉莉酸信号途径中JAZ蛋白的互作分子机理奠定基础。[方法]对harp1基因序列进行密码子优化，使用蛋白预测软件预测HARP1中的信号肽和成熟肽。基于以上信息构建目的蛋白的表达质粒并进行诱导表达，使用亲和层析、酶切、透析、离子交换层析、凝胶过滤层析等多种手段对目的蛋白进行纯化。使用SDS-PAGE和Western blot对蛋白进行分析和检测。[结果]通过优化将harp1基因密码子适应度值（CAI）从0.39提升到0.95。蛋白预测软件预测N末端21个氨基酸为信号肽，信号肽与成熟肽切割位点在第21位丙氨酸和第22位亮氨酸之间，成熟肽为第22位亮氨酸至第122位精氨酸。构建表达质粒pETDuet1-His6-MBP-3C-HARP1(22-122)，IPTG能够诱导目的蛋白表达，使用Ni-NTA柱纯化出融合蛋白His6-MBP-3C-HARP1(22-122)，3C蛋白酶能够切除His6-MBP标签，使用阴离子交换柱成功分离His6-MBP标签和HARP1(22-122)蛋白，使用Superdex 200 increase Gel Filtration Column进一步纯化获得单体HARP1(22-122)蛋白。[结论]成功建立HARP1蛋白体外表达与纯化体系。