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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
程媛媛 张彦明 向华 康恺 李艳明 徐磊 董玲娟 张三东
【目的】建立牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌的双重PCR检测方法。【方法】根据布鲁氏菌IS711序列和单增李斯特菌毒力因子HlyA序列设计并合成引物,建立双重PCR检测方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检测,并制备污染模型乳,通过直接检测、增菌后检测、细菌富集后增菌检测,确定最低检测限。【结果】建立了牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法,该方法特异性好、敏感性高、可重复性好。布鲁氏菌和单增李斯特菌单PCR检测最小DNA质量浓度分别为0.282和3.33 pg/μL,双重PCR检测最小DNA质量浓度分别为2.82和33.3 pg/μL。感染模型乳不经过增菌,布鲁氏菌和单增李斯特菌最低检测...
关键词：
布鲁氏菌 单增李斯特菌 双重PCR 牛奶
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
周阳 祝长青 郭桂萍 徐幸莲 徐宝才 薛建丽 蒋原 杨军 郭云昌 刘秀梅 付瑞燕
【目的】确定适用于不同条件下快速检测单增李斯特氏菌的方法。【方法】以单增李斯特氏菌标准菌株CMCC54004和市售盐水鸭、凉拌菜为研究对象,按照国家食品安全标准(GB 4789.30-2010)对检测样品进行选择性增菌培养,选择阴性样品进行人工布菌,比较单增李斯特氏菌蛋白条检测法、CPA恒温扩增法以及实时荧光PCR方法的检测效果,并以传统平板分离法进行验证。【结果】蛋白条检测法操作简单但灵敏度低,最低检测限为106cfu/mL;实时荧光PCR方法灵敏度高,最低检测限为101 cfu/mL,但操作繁琐,对操作技术及实验室条件要求较高;CPA恒温扩增方法灵敏度相对较高,最低检测限为105 cfu/...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王芳 冯宇 张阁 蒋卉 朱良全 丁家波
【目的】建立高通量牛布鲁氏菌间接ＥＬＩＳＡ诊断方法，为科学高效诊断牛布鲁氏菌病提供技术手段。【方法】以提纯的猪布鲁氏菌Ｓ２株脂多糖（ＬＰＳ）作为包被抗原，采用棋盘滴定法确定了抗原包被浓度、包被液、抗原包被时间、封闭液、样品稀释液、血清稀释倍数、兔抗牛酶标抗体稀释液、兔抗牛酶标抗体稀释浓度、最佳ＴＭＢ底物反应时间等参数，初步建立了牛布鲁氏菌间接ＥＬＳＩＡ方法。并用上述条件初步建立的方法对１７６份牛布鲁氏菌病阳性血清和１３２份牛布鲁氏菌病阴性血清进行检测。检测结果经ＳＰＳＳ１７．０软件分析，构建受试者工作特征曲线（ＲＯＣ）及曲线下面积，确定敏感性和特异性；通过ＹＯｕｄＥｎ指数确定阴阳性判定的临界点．．．
关键词：
布鲁氏菌 间接ELISA 特异性 敏感性
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张剑 马卫明 张亮 何洪彬 丁家波 杨宏军
【目的】布鲁氏菌virb8蛋白是布鲁氏菌的重要毒力因子,本研究拟构建含布鲁氏菌Virb8基因的原核表达载体,利用纯化蛋白作为包被抗原,建立检测牛布鲁氏菌血清抗体的间接ELISA方法(iELISA)。【方法】根据GenBank中的牛型布鲁氏杆菌Virb8序列,设计一对引物,以布鲁氏菌疫苗株S2全基因组DNA为模板扩增Virb8的基因,将目的基因克隆入PEASY-T3,经测序正确后,与载体pET-32a(+)连接,构建重组表达质粒pET-32a-Virb8,转化E.coli BL21(DE3),诱导表达融合蛋白pET-32a-Virb8,经SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定后,采用...
关键词：
布鲁氏菌 Virb8 间接ELISA
[期刊] 淡水渔业
[作者]
刘晓丹 肖自东 孙威 李席席 周一凡 张晓君
根据NCBI已发表的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)促旋酶B亚单位基因gyrB和编码细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的保守序列设计引物,建立了一种快速检测青虾源维氏气单胞菌的双重PCR检测方法。结果显示:青虾源维氏气单胞菌gyrB和rpoD基因PCR扩增产物大小分别为815 bp、554 bp,而对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、非O1霍乱弧菌(non-O1 Vibrio cholerae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)扩增结果皆为阴性;灵敏性试验结果显示该方法检测到的最低菌体DNA量为1.8×10~(-2) ng/μL,且10份送检样本检测结果与传统细菌分离鉴定结果相一致。结果表明,双重PCR检测方法特异性好、灵敏性高,适用于青虾源维氏气单胞菌的快速检测。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘海泉 赵强 孙晓红 吴启华 潘迎捷 赵勇
【目的】通过对检测食源性致病菌单核细胞增生性李斯特氏菌(LM)的多重PCR体系的优化,建立一种能够在食品样品中应用的四重PCR。【方法】采用热裂解提取菌液和菌落DNA,以16SrRNA、inlAB、iap、hly基因为靶基因设计引物,从影响多重PCR扩增的引物浓度、退火温度进行优化。【结果】通过其它5种同属异种菌即英诺克李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、威尔西李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌及副溶血性弧菌均未扩增出特异性的片段。纯培养物的最低检测限为102CFU/mL,模拟污染的生猪肉检测限不大于0.4CFU/g。【结论】通过菌落获得DNA的多重PCR方法更好,该方法具有敏感、特异、快速及...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
潘晓艺 沈锦玉 郝贵杰 姚嘉贇 徐洋 尹文林 孙逢明 吴颖蕾
针对GenBank中登录的气单胞菌属(Aeromonas)的毒力基因甘油磷脂胆固醇酰基转移酶基因(GCAT)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的16SrRNA基因的保守区设计2对特异性引物。通过进行双重PCR反应体系优化,PCR产物的测序鉴定和特异性试验,建立了一种能同时检测气单胞菌(Aeromonasspp.)和嗜水气单胞菌的双重PCR检测方法。用此方法对5株嗜水气单胞菌、7株其他不同种的气单胞菌和5株非气单胞菌属菌株进行双重PCR检测。结果显示,气单胞菌和嗜水气单胞菌在GCAT基因的扩增区都能得到有效扩增,其中嗜水气单胞菌能同时在16SrRNA基因扩增区得到有效扩增...
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
刘宗晓 刘荭 史秀杰 高隆英 岳志芹 吕建强 何俊强 江育林 谢从新
选取杀鲑气单胞菌A层A蛋白(VapA)保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针。以ATCC标准株10倍系列稀释,通过血球计数板计数后进行实时定量PCR,制作标准曲线。通过SDS软件获得细菌数量(X)与Ct值的关系为:Ct=-3.1574lgX+43.6841(相关系数R2=0.992)。实时定量PCR的检测限为6个细菌。建立的方法对杀鲑气单胞菌典型株和非典型株具有较好的特异性,与其他细菌没有交叉反应。杀鲑气单胞菌实时定量PCR方法的建立,对于快速口岸检疫、临床诊断和疫病监测具有重要的应用价值。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张枭 李绍戊 王荻 曹永生 卢彤岩
鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)是导致虹鳟(Oncorhynchus mykiss)肠炎红嘴病的病原。本研究以鲁氏耶尔森菌毒力因子rup A基因为靶标设计1对特异性引物,以含有rup A基因部分序列的重组质粒为标准品构建标准曲线,优化建立检测鲁氏耶尔森菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并对腹腔注射鲁氏耶尔森菌菌悬液的虹鳟肝、肾、脾、血液样品进行检测。结果显示,设计的引物具有良好的种间特异性,标准曲线线性方程为y=–3.3766x+40.012(R2=0.9958);最
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
刘梅 黄艳 刘佳 叶可萍 李春保 周光宏
[目的]本文旨在研究绿色魏斯氏菌与单增李斯特菌共存对单增李斯特菌的生长能力、毒力基因表达及细胞黏附能力的影响,揭示乳酸菌与单增李斯特菌之间的交互作用机制。[方法]采用膜隔离装置,取4℃贮藏条件下放置0、12、24、48和96 h的菌悬液分别测定单增李斯特菌和绿色魏斯氏菌的数量,同时提取单增李斯特菌的RNA进行反转录和荧光定量PCR,分析单增李斯特菌6种主要毒力基因(hly A、prf A、bsh、act A、sig B和inl A)的表达情况。利用Caco-2细胞进行绿色魏斯氏菌与单增李斯特菌的竞争、排斥和置换试验,观察单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附效果。[结果]产细菌素绿色魏斯氏菌C1可降低单增李斯特菌的数量,而不产细菌素绿色魏斯氏菌C2对单增李斯特菌的生长影响不大。C1和C2的代谢产物使单增李斯特菌6种毒力基因表达量下调,且C1导致的下调趋势比C2大。C1主要通过置换和竞争作用来抑制单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附,而C2的作用较弱。[结论]产细菌素绿色魏斯氏菌C1比不产细菌素绿色魏斯氏菌C2能够更好地控制单增李斯特菌的生长,抑制相关毒力基因的表达,并主要通过置换和竞争作用来抑制单增李斯特菌对Caco-2细胞的黏附。产细菌素绿色魏斯氏菌C1可作为单增李斯特菌的防控菌株。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
刘凯丽 赵岳 张素霞 程林丽 王莹
建立检测牛肉、牛奶中氮氨菲啶残留量的高效液相色谱法。用乙腈-甲醇(含0.125 mol/L甲酸铵)溶液(体积比50∶50)提取试样中的氮氨菲啶。提取物经40℃下蒸干、甲醇溶解和正己烷除脂后,采用ODS-3 C18色谱柱,以甲醇-0.1%(体积分数)甲酸水为流动相,梯度洗脱程序分离药物与样品基质,在380 nm的紫外检测波长下进行高效液相色谱检测。试验结果表明,氮氨菲啶在0.005~1.000μg/mL质量浓度范围内呈良好的线性关系(r>0.99)。对空白牛肉、牛奶进行20~500μg/kg的药物添加回收试验,平均回收率范围为80.3%~93.0%,日内变异系数为2.8%~5.3%,日间变异系数...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
韩广涛 杨志辉 朱杰华 赵冬梅 韩彦卿
【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)和黑胫病菌(Pectobacterium atroseptica)。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
王真 鲁琳 吴清民
布鲁氏菌病是一种重要的人畜共患病,也是引起动物繁殖障碍的主要疾病之一。近年来,我国人、畜间布鲁氏菌病呈高发态势,严重威胁畜牧业发展和人群身体健康。及时准确诊断对控制和净化布鲁氏菌病具有重要意义。本研究从病原学和血清学两方面对布鲁氏菌病的现有诊断技术进行概述,同时指出布鲁氏菌免疫原性蛋白抗原的筛选和研究,对布病的控制和净化意义重大。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
何苹萍 赵永贞 陈秀荔 张彬 黄婷 彭敏 杨春玲 杨彦豪 李咏梅 邵朋威 陈晓汉
研究基于哈氏弧菌HSP60基因序列设计1对特异性引物,通过优化PCR条件,特异性及敏感性检测,建立了一套哈氏弧菌特异性PCR检测方法。结果表明,该PCR检测方法可使分离自患病南美白对虾的哈氏弧菌扩增出238 bp的HSP60基因片段,其他五种对照病原弧菌未扩增出任何条带;检测方法最低能检测出2.1 pg的哈氏弧菌基因组DNA。表明建立的哈氏弧菌PCR检测方法可用于该菌引起的水产动物疾病的快速诊断。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
孙晶晶 高晓建 张晓君 马丽娜 阎斌伦 白雪松 赵佳铭 毕可然 秦蕾
本研究检测了分离自发病大菱鲆、半滑舌鳎及鲤鱼的22株病原鳗弧菌(Vibrio anguillarum)毒力相关基因的携带情况,并建立了病原鳗弧菌的分子生物学检测方法。以PCR方法检测8个毒力相关基因的分布,结果显示,22株病原鳗弧菌均可扩增出6个基因(emp A、vah1、vah4、fla A、rtx A和ton B)目的条带,未扩增出vir A和ang M基因;针对vah4和rtx A设计引物进行双重PCR扩增,同一PCR反应体系可扩增出两条目的条带,灵敏度为2.4×103 CFU/ml,对照菌无任何扩增条带;以vah4设计引物进行LAMP扩增,病原鳗弧菌可扩增出阶梯状条带,呈现阳性反应,6...
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