为研制检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的试剂盒,对IBRV gD蛋白主要功能域的表达及免疫原性进行研究。根据NCBI数据库录入的1型牛疱疹病毒(bovine herpesvirus type 1)gD蛋白序列(Gen Bank登录号为NC_001847)设计引物,用PCR扩增gD基因类免疫球蛋白结构域,构建原核表达载体pET32a–Δg D,转化大肠杆菌Rosseta(DE3)感受态细胞,并诱导重组蛋白表达。经SDS–PAGE分析,获得了相对分子质量约43 000的目的蛋白,该蛋白的相对分子质量与gD

【目的】克隆传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)CJ-13株糖蛋白(G蛋白)基因,构建原核表达载体,并检测其在大肠杆菌BL21中的表达情况,为IHNV诊断试剂盒和疫苗的研制奠定基础。【方法】设计1对G基因特异引物对G基因进行RT-PCR扩增,将扩增产物克隆到pGEM-T Easy载体上,构建重组质粒pGEM-T Easy-G,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将G基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,构建传染性造血器官坏死病病毒G基因原核表达质粒pET-32a-G,转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法对表达产物进行分...

将鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)河南长葛株gD基因重组到鸡痘病毒基因组中,获得了能高效表达糖蛋白D的重组鸡痘病毒(rFPV-gD)。将rFPV-gD经皮下刺种途径接种30日龄的固始鸡,用ILTV商品弱毒疫苗经滴鼻、点眼途径免疫试验鸡,同时设非免疫对照鸡群。分别于免疫后7、14、21、28、35和42 d采血分离血清,用微量血清中和试验测定ILTV抗体效价,并于免疫后42 d用ILTV强毒攻击所有试验鸡只。血清中和抗体检测结果表明:疫苗对照组与重组病毒组差异不显著(P>0.05),而重组病毒组和疫苗对照组与空白对照组相比差异均显著(P

为了获得具有良好免疫活性的基因工程抗原蛋白，利用毕赤酵母真核表达系统，表达猪传染性胃肠炎（河北分离株）的纤突糖蛋白。根据Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＴＧｅＶ Ｓ基因设计一对引物，经ＰＣＲ扩增出长２．２ ｋＢ的目的基因Ｓ，将Ｓ基因亚克隆于Ｐ ＰＩＣ９ｋ载体，转化ＴＯＰ１０感受态，ＰＣＲ、酶切鉴定阳性克隆，ＳａｌⅠ线性化重组穿梭质粒ＰＰＩＣ９ｋ－Ｓ，然后电转ＧＳ１１５感受态，利用Ｇ４１８抗性进行多拷贝整合子初步筛选，提取基因组并做ＰＣＲ鉴定，得到阳性菌株，经诱导发酵后，上清发酵液经ＳＤＳ－ＰａＧｅ电泳检测，显示获得分子量为８２ ｋＤａ左右的目的蛋白，同时用ＷｅＳＴｅＲｎ－ＢｌＯＴＴＩｎＧ检测到一条特异的目的．．．

从患传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)病的鳜体内获得ORF093基因。采用PCR方法扩增ISKNV ORF093基因全长,克隆入原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导表达,Ni柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备兔抗重组093蛋白血清,免疫印记分析兔抗血清的特异性,中和实验和免疫保护实验分析重组093蛋白的免疫原性。结果显示:ISKNV重组093蛋白可以在大肠杆菌中以包涵体形式存在;制备的兔抗血清可以特异性识别重组093蛋白,对ISKNV具有中和作用,可给鱼体提供至少10 d的100%预防保护;重组093蛋白...

【目的】在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1-NTD蛋白,研究其免疫原性,为基于PEDV S蛋白的基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。【方法】PCR扩增PEDV S1-NTD基因,构建其重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD和重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD。将Ac-PEDV S1-NTD转染sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。将P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,Western blot鉴定重组蛋白的表达,空斑试验测定重组杆状病毒的滴度。在此基础上,分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,1和3的P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,并在感染后1,2,3,4和5 d收集细胞,通过Western blot和空斑试验分别检测目的蛋白的表达量和重组杆状病毒的增殖情况。将MOI为0.1的P3代重组杆状病毒皮下注射免疫BALB/c小鼠,每隔2周免疫1次,共免疫3次,以注射PBS、空载体Bacmid和PEDV商业疫苗为对照组,于首免后不同时间采集血液分离其血清,ELISA法检测血清中PEDV特异性抗体的水平;于首免后35 d剖取小鼠脾脏,分离其淋巴细胞;PEDV刺激后,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖情况。【结果】PCR扩增获得了约738 bp的PEDV S1-NTD基因;成功构建了重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD、重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD和重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。利用杆状病毒表达系统在sf9细胞内成功表达了重组PEDV S1-NTD蛋白,且杆状病毒以MOI为1感染sf 9细胞后在第3天蛋白表达量达到最高。在首免后35 d,重组杆状病毒免疫组小鼠血清效价达到最高值,为1∶5 000,与商业疫苗组效价一致;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD免疫组小鼠脾淋巴细胞对PEDV的刺激也发生了显著增殖(P0.05)。【结论】成功构建了重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD,在昆虫细胞中成功表达了PEDV S1-NTD蛋白,且具有较好的免疫原性。

采集上海地区奶牛场牛传染性鼻气管炎抗体阳性牛病料,按常规PCR鉴定和MDBK细胞盲传未能获得牛传染性鼻气管炎病毒,后采用外周血淋巴细胞与MDBK细胞共培养加ConA刺激的方法从抗体阳性牛的血液样品中分离到8株病毒类似牛疱疹病毒1型(BHV-1),命名为BHV-1/SH株。分离毒株经MDBK细胞多次盲传后,细胞出现圆缩、聚集成葡萄串样、拉网等BHV-1特征性病变。用PCR方法从分离病毒BHV-1/SH7株DNA中扩增出与BHV-1 tk基因大小一致的条带,BHV-1/SH7株tk基因与从中国流产牛胚胎分离的NM06株(JN787955.1)的核苷酸同源性为99%,与美国NVSL challeng...

【目的】原核表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)次要衣壳五邻体顶点蛋白(H240R),并研究其免疫原性。【方法】运用生物信息学软件初步预测分析H240R蛋白的理化性质、二级和三级结构。目的基因序列密码子优化后全基因合成,利用基因重组技术构建重组载体pET28a/H,通过原核系统表达目的蛋白,筛选最优的诱导温度和诱导时间。目的蛋白(包涵体)通过含2M尿素洗涤缓冲液洗涤和亲和层析进行纯化。利用梯度透析对纯化的目的蛋白进行复性,Western和Dot-ELISA鉴定复性的目的蛋白。复性蛋白和佐剂ISA201乳化后免疫小鼠,评价H240R蛋白免疫原性及其在小鼠体内诱导的抗体消长规律。【结果】生物信息学分析显示H240R蛋白分子量约为27 kDa,等电点为9.40,无跨膜结构域,抗原指数较高。成功构建大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)/pET28a/H,在不同温度诱导条件下H240R蛋白均以包涵体形式表达。包涵体蛋白经过洗涤和亲和层析纯化后,纯度达85%以上。大约65%纯化蛋白可通过梯度透析进行复性。Western显示His抗体可以和融合蛋白结合显色,表明目的蛋白表达正确,Dot-ELISA显示阳性血清和复性的目的蛋白反应,表明复性的H240R蛋白具有正确的构象。复性蛋白免疫小鼠后,可刺激小鼠产生抗体,二免后10 d达到平台期,可以稳定持续30 d左右。【结论】ASFV衣壳五邻体顶点蛋白H240R在原核系统中以包涵体形式表达,纯化复性的目的蛋白具有良好的免疫原性,并且可以和阳性血清反应。这些可为进一步研究H240R蛋白的结构和功能,以及ASFV亚单位疫苗研制提供参考和思路。

【目的】原核表达猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)spike蛋白亲和肽(SQHT),检测其病毒亲和性,为建立TGEV诊断方法奠定理论和物质基础。【方法】人工合成TGEV spike蛋白亲和肽基因,亚克隆后将该基因分别插入至原核表达载体pET-32a和pGEX-6p-1中,构建重组质粒pET-32a-SQHT和pGEX-6p-SQHT,对重组质粒进行BamHⅠ单酶切和BamHⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。将重组质粒分别转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),用IPTG进行诱导表达,对其表达产物的生物学活性进行检测。【结果】亚克隆获得了150 bp的TGEV spike蛋白亲和肽基因。成功构建了重组质粒pET-32a-SQHT和pGEX-6p-SQHT,并诱导表达出重组蛋白TRX-SQHT和GST-SQHT,其分子质量分别为25和31 ku。Western blot分析表明,2种重组蛋白与TGEV病毒粒子具有良好的亲和性;Dot-ELISA分析表明,2种重组蛋白与TGEV病毒粒子的最低结合滴度TCID_(50)为5×10~2 mL~(-1)。特异性试验表明,重组蛋白TRX-SQHT和GST-SQHT均可与TGEV产生特异性结合,而不与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(PoRV)结合。【结论】使用原核细胞成功表达了TGEV spike蛋白亲和肽,表达的重组蛋白具有很好的TGEV特异亲和性。

为了研究猪传染性胃肠炎病毒膜蛋白(M蛋白)亲和肽的病毒亲和性,建立快速有效的TGEV检测方法,设计了1条含有TGEV M蛋白亲和肽的串联基因,核苷酸序列依据大肠杆菌偏爱密码子进行优化,人工基因合成获得了含有M蛋白亲和肽基因的重组质粒pUC57-MQHT。然后,根据合成基因的序列,设计合成了1条特异性引物,以pUC57-MQHT为模板,通过PCR获得了150 bp的TGEV M蛋白亲和肽基因。亲和肽基因通过BamHⅠ/XhoⅠ多克隆位点分别插入至原核表达载体pET-32a和pGEX-6p-1,获得重组质粒pET-32a-MQHT和pGEX-6p-MQHT。重组质粒经BamHⅠ单酶切和BamHⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。重组质粒分别转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导,获得了重组蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT,分子质量分别为25,31 ku。切胶纯化后,重组蛋白TRX-MQHT和GST-MQHT分别经His标签单克隆抗体和GST标签单克隆抗体鉴定,鉴定结果表明,获得的纯化蛋白为目的蛋白。Western Blot分析表明,2种重组蛋白可与TGEV特异性结合。Dot-ELISA分析表明,在TGEV滴度为1×10~3,5×10~2,2.5×10~2 TCID50/mL时2种重组蛋白都可显示出阳性反应,而在1.25×10~2 TCID50/mL滴度时无可见斑点,具有良好的TGEV亲和性。阻断试验表明,1∶100或1∶200稀释的TGEV阳性血清可完全阻断TGEV H株(1×10~5 TCID50/mL)与2种重组蛋白的结合,特异性良好。为建立TGEV诊断方法奠定了一定的理论和物质基础。

【目的】旨在评价嗜水气单胞菌外膜蛋白AHA2991的免疫学功能，为探索嗜水气单胞菌渔用疫苗候选抗原提供理论依据。【方法】通过生物信息学分析AHA2991氨基酸序列，揭示不同菌株间的亲缘关系；分子克隆构建AHA2991表达菌株并确定最佳诱导条件；包涵体洗涤及SDS-PAGE切胶纯化获得AHA2991并免疫红鲫；Western blotting检测AHA2991红鲫血清的特异性与效价；ELISA模拟AHA2991红鲫血浆与嗜水气单胞菌的体外相互识别作用；酸性、碱性磷酸酶（ACP、AKP）测定与细胞吞噬作用评价AHA2991非特异性免疫功能；组织病理学切片探究AHA2991免疫对红鲫内脏的影响情况。【结果】AHA2991蛋白家族在不同菌株间具有同源性，不同菌株间亲缘关系较近，尤其在气单胞菌间亲缘关系更近；AHA2991的最佳诱导条件为：菌液浓度OD_(600) =1.0，IPTG终浓度0.1 mmol/L，在28 ℃下诱导8 h。红鲫AHA2991抗血清具有良好的特异性，其效价为1:800；体外AHA2991血浆对嗜水气单胞菌具有识别作用，滴度可达1:3 200；ACP、AKP指标及细胞吞噬作用均显示AHA2991激活红鲫非特异性免疫；组织病理学切片表明AHA2991免疫对红鲫内脏结构无影响。【结论】嗜水气单胞菌AHA2991具有良好的免疫原性，有望成为嗜水气单胞菌渔用疫苗的候选抗原成分。

LrrG蛋白是无乳链球菌较保守的表面蛋白之一。为获得罗非鱼源无乳链球菌LrrG蛋白并探讨其在罗非鱼体内的免疫原性,本实验根据GenBank中已报道的人源无乳链球菌LrrG基因序列,设计特异性引物,扩增获得罗非鱼源无乳链球菌的LrrG基因。分析表明,其ORF为2 361 bp,编码786个氨基酸,与人源无乳链球菌LrrG基因核苷酸序列的相似性高达98.48%。LrrG蛋白含有3个保守的LRR结构域,并可形成多个抗原表位。将LrrG基因片段克隆转入原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a(+)/LrrG,E.coli BL21(DE3)22℃诱导表达6 h。SDS-PAGE显示...

将SARS冠状病毒(SARS-CoV)表面的主要结构蛋白刺突蛋白S144-643的基因片段(nt430-nt1929)克隆入表达质粒pET-28b中,并在大肠杆菌中表达。S144-643蛋白分子质量为55 ku左右,以包涵体形式存在于细菌中。ELISA及Western blot证明,S144-643可以与SARS康复病人的阳性血清发生特异性反应,免疫新西兰大白兔可以诱发产生较高水平的特异性抗体,因而证明原核表达的S144-643具有良好的免疫原性。

鲤春病毒血症病毒(SVCV)能够引起鲤科鱼类大量死亡,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的重要疫病,也是我国唯一被列为一类疫病的鱼类传染病。为建立SVCV的快速免疫学诊断方法,研究其主要结构蛋白间的免疫原性差异,实验首先采用原核表达系统克隆并诱导表达,纯化SVCV的核蛋白(N)、磷蛋白(P)和基质蛋白(M),并进一步免疫新西兰白兔制备抗血清,抗血清经Protein A柱进一步纯化获得3种蛋白的多克隆抗体。利用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫印迹实验(Western blot)对抗体效价和特异

为建立一种针对牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotrachetitis virus,IBRV）的早期快速检测方法，并能判定免疫后是否再次发生感染，本研究利用原核表达IBRV gB蛋白，并通过SDS-PAGE和Western blot检测gB蛋白的表达，并初步建立基于gB蛋白检测IBRV的间接ELISA方法。结果表明：1）对IBRV标准阳性血清，本试验方法的最低检测限度为1∶4 096，说明建立的gB-ELISA检测方法具有较高的敏感性。2）该方法对其他4种常见的牛疫病阳性血清检测均为阴性，不存在交叉反应，表明该方法具有良好的特异性。3）在对200头牛的临床样品的检测中，该方法与IDEXX(IBRV gB X3)抗体检测试剂盒符合率高达97.5%。综上，本研究建立的gB-ELISA检测方法敏感性高，特异性好，该方法为开发一种在感染早期快速对疾病进行诊断，并可以判定疫苗免疫后是否再次发生IBRV感染的试剂盒奠定基础。