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[期刊] 华北农学报
[作者]
李瑞国 苗朝华 侯健 关宏 安晓荣 陈永福
将带有新霉素基因(neo)和绿色荧光蛋白基因(GFP)的质粒pEGFP-C1进行了改造,去掉neo基因的启动子(Psv40),在无启动子的neo和完整的GFP基因两侧分别加入一个LoxP位点。然后将带有LoxP位点、筛选标记基因和报告基因的结构装入左右分别为牛β-casein基因1590bp和5833bp的同源臂结构中,构建成无启动子基因打靶载体pT-1590-LoxP-GFP-LoxP-5833。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
胡林勇 陈华涛 李倩 徐晓彬 王爱华 靳亚平
【目的】构建山羊β-乳球蛋白(BLG)基因打靶载体,以期用人乳白蛋白(hALA)基因的编码区置换山羊BLG基因的编码区,借助BLG的内源性调控序列指导hALA的表达。【方法】以山羊血液基因组为模板PCR扩增获得BLG基因的5′端侧翼序列(BLG5)、第5外显子和第5内含子的部分序列(E5)和3′端侧翼序列(BLG3),同时以人血液基因组为模板克隆了hALA基因的基因组序列(ALA),并将上述片段连接到克隆载体pMD18 T-simple或pBluescript KS(-),得到载体pB5T,pB3T,pAKS和pAEKS。对pB5T进行亚克隆,将BLG5连接到pAEKS中,构建载体pBAE;最...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王伟权 杨翠平 王景雪 梁超 刘莉
GluB-4是水稻种子谷蛋白的编码基因,在种子成熟过程中,由GluB-4启动子调控,在胚乳中特异地表达。以水稻基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到GluB-4启动子片段,序列分析结果表明:获得的启动子片段的大小为1 560 bp,与已报道的该启动子序列相比较,其核苷酸序列同源性为99.8%。该启动子区域含有TATA-box,CAAT-box,GCN4基序,Skn-1基序等胚乳特异表达启动子所必需的正调控元件,同时还含有高水平转录调控因子5UTR Py-rich stretch序列。利用该启动子构建了植物种子特异表达载体pCGB4P,为进一步的研究工作奠定了基础。
关键词：
水稻 GluB-4基因 启动子 谷蛋白
[期刊] 华北农学报
[作者]
岳永莉 于海泉
小鼠脂肪型脂肪酸结合蛋白（ＦＡＢＰ４）的启动子／增强子元件是脂肪组织特异性启动元件，为了鉴定该元件在牛体细胞中的启动效果，首先以小鼠肝脏ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ克隆得到５．９ ｋＢ的ＦＡＢＰ４基因启动子片段，连入Ｐ ＭＤ１９－Ｔ载体后进行酶切及测序鉴定，经ＥＣｏ Ｔ ２２Ｉ酶切去除非核心启动子区后精简为２．３ ｋＢ的片段，通过ＳＡＣⅡ酶切将５．９ ｋＢ片段和２．３ ｋＢ片段的启动子连入红色荧光蛋白载体Ｐ ＤＳ－ＲＥＤ ２－１的多克隆位点，构建为表达质粒Ｐ ＭＦ５．９－ＲＥＤ和Ｐ ＭＦ２．３－ＲＥＤ，利用脂质体法将上述载体分别转染牛脂肪间充质干细胞及牛胎儿成纤维细胞，２４ ｈ后实时定量ＰＣＲ检测．．．
关键词：
小鼠FABP4启动子 载体构建 牛体细胞
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
王韵斐 陈秋菊 杨莎 崔易虹 杨明明 曹斌云
为研究人白介素-2基因在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达,构建人白介素-2基因的山羊β-酪蛋白位点打靶载体。以质粒pBC1为模板扩增山羊β-酪蛋白上游2.5 kb和下游3.5 kb的序列作为5′和3′同源臂,将克隆得到的人白介素-2基因和neo基因插入到2个同源臂之间,获得山羊β-酪蛋白基因打靶载体pBNI53。利用脂质体将重组质粒转染奶山羊胎儿成纤维细胞进行G418筛选,并采用PCR和实时定量PCR方法对人白介素-2基因在稳定株中的表达进行验证。检测结果表明,本试验构建的打靶载体pBNI53成功转染奶山羊胎儿成纤维细胞,将人白介素-2基因成功整合至奶山羊胎儿成纤维细胞基因组中,为通过体细胞核移植...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
唐冬生 严霞 李芳 张细权 蒋泓 于辉 高东 李月琴 周天鸿
以鳜鱼(Sinipercachuatsi)为研究对象,以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点构建多位点基因打靶载体,为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料。先构建含TK和Neo基因的通用打靶载体pCTKNeo。采用LATaq高保真酶扩增获得左、右同源重组引导臂HRDS1、HRDS2,经T质粒克隆后,分别插入到pCTKNeo载体Neo基因的上下游,构建成鳜鱼专用的多位点打靶载体pCTKNeoHRDS1/2。同样将干扰素基因hIFN插入到pCTKNeoHRDS1/2载体的Neo基因与HDRS2之间。每次克隆均经PCR、酶切和测序等鉴定DNA片段的插入及插入方向,最终构建成多位点基因打靶载体p...
关键词：
基因打靶 多基因座 载体 重复序列 鳜鱼
[期刊] 中国农业科学
[作者]
杨秋峰 蒋蔚 刘永杰 陆承平
【目的】构建一个适于嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)的基因打靶载体,并分析转化四膜虫的特性。【方法】以嗜热四膜虫组蛋白H4-I基因作为启动子,利用H4-I基因的5′和3′侧翼区作为同源臂,并且保留H4-I基因编码区的起始密码子ATG和终止密码子TGA,中间嵌入巴龙霉素抗性标记基因neo,从而构建一个基因打靶载体。将该载体电击转化到嗜热四膜虫接合株体内,使其同源重组到四膜虫H4-I基因上。通过巴龙霉素抗性筛选、PCR扩增目的基因对抗性虫株进行鉴定。光学和电子显微镜观察抗性虫株形态变化。【结果】成功构建了一个适于嗜热四膜虫的基因打靶载体,将其电击转化到四膜虫体内,抗性虫...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
段美艳 李安宁 赵志东 王明明 昝林森
【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李辉 刘庆友 石德顺
【目的】为获得高启动效率的乳腺特异启动子，对荷斯坦奶牛、娟姗牛和奶水牛的β－酪蛋白基因启动子进行比较研究。【方法】对Ｇｅｎｂａｎｋ中所收录的荷斯坦奶牛、娟姗牛和水牛β－酪蛋白基因启动子序列进行比对分析，按照保守序列分别设计启动子区和３′端ｐｌｏｙ ａ序列引物，同时设计人ＩＦｎα－２ｂ基因和ｅＧＦｐ－ｎｅｏ筛选序列引物并引入预先设计的酶切位点以方便载体构建。采集静脉血液，提取基因组Ｄｎａ。ｐＣＲ克隆β－酪蛋白基因启动子区和３′端ｐｌｏｙ ａ区，同时以实验室保存质粒为模板克隆人ＩＦｎα－２ｂ基因和ｅＧＦｐ－ｎｅｏ筛选序列。测序正确后，将各片段按设计顺序依次插入ｐ ＭＤ１８－Ｔ骨架中，构建成ｐ ＨＳ．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郑艳玲 唐爽 张涌
为了克隆山羊β-酪蛋白基因的调控区并检测5′调控区的启动子活性,利用Long PCR技术对西农莎能奶山羊β-酪蛋白基因(CSN2)5′和3′调控区进行了克隆(5′调控区分两段进行克隆,3′调控区进行直接克隆)、测序,将克隆的5′调控区的两个片段通过共有的单一性酶切位点HindⅢ融合成一个长为6.7 kb的片段,用其替代表达载体pEGFP-C1上原来的启动子CMV,指导报告基因绿色荧光蛋白(GFP)在山羊乳腺上皮细胞中的瞬时表达。结果表明,克隆的GC 3.3、GC 4.3、GC 6.6 3个片段与GenBank中登录的山羊CSN2基因相应序列相比,同源性均为99%,其包含了TATA box、GC...
[期刊] 华北农学报
[作者]
任伟 王志锋 周艳春 于洪柱 徐安凯
为了进一步提高转BADH基因植株的胁迫抗性,分离强胁迫诱导型启动子,以生长在新疆北部干旱沙漠地带的异苞滨藜(Atriplex micrantha)为研究对象,依据已经克隆的BADH基因cDNA序列,参照陈柏君等的方法,分离到长为1 509 bp的5'端上游序列(Genebank:HM230828),预测其转录起始位点为T(+1),位于ATG翻译起始位点的上游82 bp处,同时还发现了一段新的内含子序列(260 bp)。经PLACE和PLANT CARE软件分析,发现此序列具有启动子的基本转录元件:TATA盒和CAAT盒,包含多个抗逆调控元件:ABA响应元件(ABRE),水杨酸诱导元件(-58b...
关键词：
BADH基因 启动子 内含子 克隆
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵军良 巫东堂 王秀英 李改珍 巫一伦
减数分裂是有性繁殖的重要过程。已经发现,在玉米和拟南芥中,同源联会缺乏基因1(phs1),只允许同源染色体联会,而阻止非同源染色体联会。为了研究phs1在拟南芥中的表达,从拟南芥基因组中通过PCR扩增出phs1启动子,然后将phs1及其启动子克隆到含荧光表达蛋白GFP、YFP的表达载体上,最后将构建好的载体转化到根癌农杆菌中,用来转化拟南芥。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
李群 王学英 李贺 刘野 阮成江
利用PCR技术从甘蓝型油菜(Brassica napus L.)的基因组DNA和拟南芥(Arabidopsis thaliana)cDNA中分别扩增种子特异启动子napin和二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因片段,并将它们依次插入到植物表达载体pCAMBIA1390的多克隆位点处,构建了种子特异启动子napin驱动的DGAT基因植物表达载体p1390ND,冻融法将其导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404、EHA105和AGL1中,PCR检测结果证明,重组质粒p1390ND已成功导入农杆菌细胞。该载体可应用于油料能源植物种子含油量的遗传改良。
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘玲玲 车树理 禹娟红 李润红 原霁红
几丁质和β-1,3-葡聚糖是绝大多数真菌细胞壁的主要成份,可分别被几丁质酶(Chitinase,Chi)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,Glu)降解,而且它们具有协同抗真菌的作用,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶存在于大多数植物细胞中。在正常情况下,植物体内的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶只有低水平的组成型表达,但在病原菌侵染、诱导物刺激及各种伤害下可诱导产生大量的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶。而真菌病害是危害植物的主要病害之一,这些病害主要通过韧皮部运输而进一步扩展到其他部位。如果利用维管特异表达启动子调节目的基因在韧皮部高效特异地表达,就可以更为有效地发挥目的基因的...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
成勇 黄玉政 袁玉国 张信军 张玉峰 耿士忠 鞠辉明 谢庄
为了提高转基因动物乳腺特异性表达水平,构建了两种不同启动子的乳腺特异性表达载体,以比较其乳腺特异性表达效果。应用山羊β-酪蛋白或牛αs1-酪蛋白调控序列、鸡β-球蛋白隔离元件、巨细胞病毒(CMV)基因表达调控元件构建了乳腺特异性表达复合启动/增强子(Pcmv),以单一的酪蛋白启动子作为对照,与人乳铁蛋白cDNA组成乳腺特异性表达载体,并制备了转基因小鼠。经ELISA检测,复合启动/增强子构件指导人乳铁蛋白cDNA在原代转基因小鼠乳腺中重组人乳铁蛋白(rhLF)表达水平(2.0~8.1 g.L-1)明显高于单一酪蛋白启动子构件(0~12 mg.L-1),而在所有转基因小鼠的血清和唾液中未检测到r...
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