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[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
高丽娜 付元帅 施志仪 苏艳芳 张红梅
通过ＰＣＲ技术，从牙鲆（ＰａＲａｌｉＣｈｔｙｓ ｏｌｖａＣｅｕｓ）总ＲＮａ中获得牙鲆ｌｉＮ－２９基因Ｃ ＤＮａ序列，该序列全长１ ７６９ ｂＰ，包括１ ３２９ ｂＰ开放阅读框，编码４４２个氨基酸，预测其是一种多锌指结构蛋白；氨基酸序列对比分析显示，牙鲆ｌｉＮ－２９与大黄鱼（ｌａＲｉｍｉＣｈｔｈｙｓ ＣＲｏＣｅａ）的同源性最高，达９５．２５％；系统进化树分析表明，牙鲆与其他鱼类聚集一支，并且与罗非鱼的进化关系最近。荧光定量ＰＣＲ显示，在牙鲆胚胎和仔鱼发育阶段，以原肠胚期ｌｉＮ－２９表达量最高；组织表达分析表明，脑中表达最高，肌肉中最低。外源甲状腺激素（ｔｈ）在牙鲆仔鱼发育初期（ｔｈ处理后２ Ｄ、．．．
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
韦芬 何欣慰 鲍宝龙
Ras主要参与表皮生长因子家族调控细胞分裂的信号通路。采用末端快速扩增法获得了牙鲆(Paralichthys olivaceus)ras-2基因全长2 384 bp cDNA序列,该序列编码187个氨基酸,含有switchⅠ、switchⅡ、P-loop、CAAX box等Ras家族的结构特征,与川鲽(Platichthys flesus)ras-2氨基酸序列相似性最高(96.3%)。定量RT-PCR检测显示ras-2基因在牙鲆成体的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、鳃、肠、肌肉、鳍条和皮肤组织均有不同程度的表达,其中鳍条表达量最高,肌肉的表达量最低;在牙鲆变态前和变态初相对表达量较高,随着变态进行,表...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张永珍 陈松林 王磊
趋化因子是一类具有化学趋化功能的小分子分泌性蛋白,能够引导白细胞到损伤或者感染的部位,参与免疫调节和病理反应。为丰富鲆鲽鱼类趋化因子的相关基础研究,本研究克隆了牙鲆(Paralichthys olivaceus)趋化因子基因CXCL9,其全长为910 bp,开放阅读框为408 bp,编码135个氨基酸。该基因具有趋化因子超家族的典型特征,在35、37、60和77个氨基酸位置具有4个保守的半胱氨酸残基,形成两个二硫键。氨基酸序列分析表明,该基因与大菱鲆(Scophthalmus maximus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的CXCL9基因具有较高的同源性,分别为78.5%和71.0%。实时荧光定量PCR结果显示, CXCL9在正常牙鲆肝脏和脾脏中的表达量非常高,在皮肤和鳃等组织中表达量次之,说明CXCL9特异性地在免疫相关组织中表达。经迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA表达量在感染后6 h即出现高峰值,而头肾和脾脏中的高峰值出现较晚。经鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后6 h,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA的表达量升高近8倍,头肾中的表达高峰值出现在感染后24 h,而脾脏中CXCL9 mRNA的表达量在感染后6 h迅速升高10倍,逐渐降低后48 h又出现高峰,为正常水平的20倍。上述研究结果说明CXCL9基因在病原菌感染过程中有快速响应,可能参与了免疫防御过程,将有可能发展为一种牙鲆细菌性疾病的生物标记。本研究为牙鲆趋化因子超家族免疫机制的深入研究奠定了基础。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
柳学周 臧坤 徐永江 李春广 史宝 王妍妍
利用cDNA末端快速克隆(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)方法获得了漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)促黄体素(Luteinizing Hormone,LH)β亚基的cDNA全长序列,检测了LHβ亚基mRNA的组织表达水平,揭示了垂体、肝脏和卵巢中LHβ亚基mRNA在卵巢发育周期中的表达水平变化,利用酶联免疫技术(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)测定了血浆LH和雌二醇(Estrodiol,E2)表达水平的变化。结果表明,漠斑牙鲆为卵巢非同步发育分批产卵性鱼类,LHβ亚基cDN...
[期刊] 水产学报
[作者]
翟万营 张俊玲 施志仪 李巍
利用RACE-PCR技术,从牙鲆肝脏组织总RNA中克隆得到胰岛素样生长因子结合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein 1,IGFBP-1)基因的全长cDNA序列,该cDNA全长为1 070 bp,开放阅读框为729 bp,编码242个氨基酸。通过系统进化树分析,牙鲆IGFBP-1与鱼类IGFBP-1基因紧密聚为一支;通过同源性比对,牙鲆IGFBP-1基因的核苷酸序列与大菱鲆同源性最高,为95%,而其推导的氨基酸序列与其它鱼类如大菱鲆、五条、黄金鲈、红点鲑、鲤和斑马鱼的同源性分别为89%、89%、84%、79%、67%和67%。半定量RT-...
[期刊] 海洋渔业
[作者]
孙近近 张俊玲 孙文慧 施志仪
ｄａｚｌ（ｄｅｌｅｔｅｄ ｉｎ ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ－ｌｉｋｅ）基因是多种物种精子发生的重要调控因子，为探讨该基因在牙鲆（ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）性腺发育分化中的作用，本研究采用同源克隆和ｒａｃｅ技术克隆了牙鲆ｄａｚｌ基因的ｃｄｎａ序列，利用生物信息学方法分析了其序列结构，并利用实时荧光定量ｐｃｒ技术检测了该基因在牙鲆成体组织和早期发育阶段的表达情况。结果发现：牙鲆ｄａｚｌ ｃｄｎａ序列全长２ ０３１ ｂｐ，包括１０５ ｂｐ的５＇端非翻译区，１ ２７５ ｂｐ的３＇端非翻译区和编码２１７个氨基酸残基的６５１ ｂｐ开放阅读框；氨基酸同源序列比对显示该序列存在一个高度保守的ｒ．．．
关键词：
牙鲆 dazl cDNA克隆 基因表达
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
谢彩霞 邢巨斌 鲍宝龙
为了调查表皮细胞分裂原epigen基因是否与牙鲆变态发育有关,分析了从变态期牙鲆仔鱼cDNA文库中测序得到的epigen基因。发现epigen基因编码162个氨基酸,具有信号肽序列,一个跨膜结构域和EGF-like结构域。EGF-like结构域包含有可形成3个二硫键的6个半胱氨酸残基,是表皮生长因子家族的结构特征。此外,利用荧光实时定量RT-PCR,调查了epigen基因在牙鲆眼睛移动过程中的变化。相比眼睛移动之前(17DAH,day after hatching),epigen基因在眼睛移动初期(19DAH)表达明显增强,为17DAH时的2.363倍;而在眼睛移动过程的高峰期(23DAH),...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
唐春华 杨丹 左振华 黄小西 陈韬 张东裔
利用草鱼C-反应蛋白(CRP)的EST序列(CK233056)设计引物,采用快速扩增cDNA末端(SMART-RACE)的方法克隆CRP基因的5′末端,获得1个约520bp的cDNA片段.将该片段与EST拼接,得到CRP基因全长cDNA,长度为889bp,含有1个672bp的开放阅读框,两侧分别有74bp和143bp的5′和3′非翻译区域(open reading frame,ORF),CRP基因编码224个氨基酸残基,N端含有15个氨基酸残基的信号肽.利用RT-PCR半定量法对健康及被嗜水产气单胞菌人工感染的草鱼的心脏、脑、前肠、肾脏、肝胰脏、肌肉、脾等组织CRP的mRNA表达水平进行检测,...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
马慧鑫 王磊 汪林庆 周茜 陈松林
本研究克隆得到牙鲆(Paralichthys olivaceus)精氨酸酶Ⅱ基因(ArginaseⅡ,Arg-Ⅱ)全长cDNA序列,并检测了Arg-Ⅱ在牙鲆免疫组织和细菌感染过程中的时空表达模式。结果显示,Arg-Ⅱ基因cDNA全长1882 bp,包含1050 bp开放阅读框,编码349个氨基酸(预测分子量为38.02 kDa,等电点为6.42)。Arg-Ⅱ基因编码的氨基酸序列具有典型的精氨酸酶结构特征,推测与哺乳动物中的功能类似。系统进化分析显示,鱼类Arg-Ⅱ基因合成一簇,其中,Arg-Ⅱ基因与鲈鱼(Lates calcarifer)相关度最高(93%)。实时荧光定量结果显示,Arg-Ⅱ基因在健康牙鲆的肝、脾和鳃等免疫组织中有较高表达。进一步研究发现,经迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染的牙鲆成鱼中,主要免疫组织中Arg-ⅡmRNA的表达量在细菌感染后6~12 h显著上调,随后表达量恢复正常。离体培养的牙鲆巨噬细胞经迟缓爱德华氏菌感染后,Arg-Ⅱ基因也呈显著上调模式。因此,本研究结果表明,Arg-Ⅱ基因参与牙鲆响应迟缓爱德华氏菌感染的免疫过程,揭示Arg-Ⅱ基因可能在牙鲆抗病免疫中发挥重要作用。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王雨 徐伟 杨建 耿龙武 张宇婷
为初步阐明拟赤梢鱼(Pseudaspius leptocephalus)卵巢发育特征及sox3 (sry related high mobility group box 3)基因在其卵巢发育过程中的作用，本研究通过组织切片观察了拟赤梢鱼卵巢早期发育过程，利用RACE技术克隆了该鱼sox3基因cDNA全长序列，并进行生物信息学分析；利用实时荧光定量PCR技术分析了sox3基因在拟赤梢鱼不同组织及性腺不同发育时期的表达模式。结果显示，拟赤梢鱼卵巢在孵化后45 d分化形成，160 d时由Ⅰ期进入Ⅱ期，孵化后360 d，卵巢仍处于Ⅱ期。拟赤梢鱼sox3基因cDNA全长为1800 bp (NCBI登录号：MT952206)，编码299个氨基酸，存在保守的HMG结构域。氨基酸序列比对和系统进化树分析结果显示，拟赤梢鱼SOX3蛋白与斑马鱼(Danio rerio)、翘嘴鲌(Culter alburnus)亲缘关系最近。此外，sox3基因在拟赤梢鱼卵巢中表达量最高，其次是脑、眼睛，在精巢和其他组织中微量表达；在性腺分化过程中，sox3基因在卵巢中表达量显著高于未分化性腺和精巢，在卵巢发育阶段表达量不断升高，而在精巢中持续低水平表达。综上，本研究推测sox3基因主要参与拟赤梢鱼卵巢的分化和发育。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
施志仪 吴明林 付元帅
let-7是时序发育过程中的重要调控因子,在促进幼体向成体转变过程中起着极其重要的作用。为探讨let-7对牙鲆(Paralichthys olivaceus)从幼体到成体转变的变态发育过程的影响,本实验对let-7进行了克隆与表达研究,并预测了其可能的靶基因。利用普通PCR技术从牙鲆中成功鉴定出let-7及其前体序列,该前体序列在不同的物种间具有高度的保守性。运用实时荧光定量RT-PCR方法分析let-7在牙鲆变态发育不同阶段的表达,结果发现,水温(16±0.5)℃条件下,在牙鲆变态发育的前5个阶段(孵化后17、20、23、29、36 d),let-7的表达量逐渐上升,在变态末期(36 dph...
[期刊] 海洋渔业
[作者]
王古樾 付元帅 施志仪 张俊玲
通过PCR技术,从牙鲆(Paralichtys olvaceus)总RNA中克隆了牙鲆Dicer基因序列,该序列全长6 585bp,包括5 691 bp的开放阅读框,编码1 896个氨基酸。在多个物种间的蛋白序列对比中,牙鲆Dicer与其它物种的同源性平均高达78%,与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)同源性最高达到89%;在进化树分析中,牙鲆Dicer与其它鱼类Dicer聚集一支。荧光定量PCR显示,牙鲆Dicer基因在牙鲆大脑里的表达最高。同样的,在牙鲆胚胎和仔鱼早期发育阶段里也发现了相对高水平的Dicer mRNA表达。在用甲状腺激素(TH)处理过程中发现,牙鲆Di...
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
杨绒 陈松林 李伟 王志坚
抗菌肽hepcidin是由hepcidin基因编码产生的小分子多肽,是机体天然免疫的重要因子。本文利用RT-PCR的方法分析表明,抗菌肽hepcidin基因在牙鲆成鱼不同组织和不同发育时期胚胎中普遍表达,但是表达水平存在着明显的差异。
[期刊] 水产学报
[作者]
龚小玲 鲍宝龙 杨桂梅 任大明
在前期的研究中,克隆到牙鲆变态早期和变态前差异表达的parvalbumin基因片断cDNA。为了克隆parvalbumin基因的全长cDNA,构建了变态早期(孵化后23d仔鱼)牙鲆头部的全长cDNA文库,并对文库的滴度和插入片段大小进行了评估。同时采用锚定PCR法从cDNA文库筛选出parvalbumin基因的全长cDNA。结果表明,所构建的牙鲆变态早期头部cDNA文库的滴度为1.2×106PFU·mL-1,插入片段的平均长度为1000bp左右。parvalbumin基因的全长cDNA的长度为603bp,编码109个氨基酸,含有两个EF手型钙离子结合域:DQDGSGFIEEEEL(52～64)...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙海龙 宋娟 高志红 倪照君 章镇
【目的】从‘大嵌蒂’果梅中克隆PmKNAT2,并对其结构特征及表达模式进行分析,为研究果梅雌蕊败育的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】在NCBI中查找与果梅相似性很高的桃KNOPE2(KNAT2的同源基因)序列(EF093491),根据桃的KNOPE2序列设计特异引物;采用改良CTAB法提取‘大嵌蒂’果梅花芽总RNA;通过RT-PCR和RACE技术获得基因cDNA序列全长;使用DNAMAN软件进行序列拼接;利用NCBI数据库中的BLASTn和BLASTp程序进行相似性分析;通过生物信息学方法分析结构特征;用DNAMAN软件分析基因的ORF和氨基酸序列;MEGA4.0软件进行系统进化树的构建;...
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