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[期刊] 中国水产科学
[作者]
施志仪 吴明林 付元帅
let-7是时序发育过程中的重要调控因子,在促进幼体向成体转变过程中起着极其重要的作用。为探讨let-7对牙鲆(Paralichthys olivaceus)从幼体到成体转变的变态发育过程的影响,本实验对let-7进行了克隆与表达研究,并预测了其可能的靶基因。利用普通PCR技术从牙鲆中成功鉴定出let-7及其前体序列,该前体序列在不同的物种间具有高度的保守性。运用实时荧光定量RT-PCR方法分析let-7在牙鲆变态发育不同阶段的表达,结果发现,水温(16±0.5)℃条件下,在牙鲆变态发育的前5个阶段(孵化后17、20、23、29、36 d),let-7的表达量逐渐上升,在变态末期(36 dph...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
吴明林 施志仪 付元帅 张俊玲
MicroRNAs(miRNAs)通过抑制编码基因的转录调控关键的生物学进程。研究发现,let-7是时序发育过程中的重要调控因子,在促进幼体向成体转变的发育过程中起着极其重要的作用。利用Solexa测序技术从牙鲆中成功鉴定出let-7家族的10个成员((let-7a,let-7b,let-7c,let-7d,let-7e,let-7f,let-7g,let-7h,let-7i,let-7j)。相对于let-7家族其他成员,let-7d的拷贝数最多,推测其在牙鲆发育过程中扮演着更重要的角色。运用实时荧光定量PCR方法分析let-7d在牙鲆变态发育不同时期的表达,结果发现,在对照组和甲状腺激素处理...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
谢彩霞 邢巨斌 鲍宝龙
为了调查表皮细胞分裂原epigen基因是否与牙鲆变态发育有关,分析了从变态期牙鲆仔鱼cDNA文库中测序得到的epigen基因。发现epigen基因编码162个氨基酸,具有信号肽序列,一个跨膜结构域和EGF-like结构域。EGF-like结构域包含有可形成3个二硫键的6个半胱氨酸残基,是表皮生长因子家族的结构特征。此外,利用荧光实时定量RT-PCR,调查了epigen基因在牙鲆眼睛移动过程中的变化。相比眼睛移动之前(17DAH,day after hatching),epigen基因在眼睛移动初期(19DAH)表达明显增强,为17DAH时的2.363倍;而在眼睛移动过程的高峰期(23DAH),...
[期刊] 海洋渔业
[作者]
孙近近 张俊玲 孙文慧 施志仪
ｄａｚｌ（ｄｅｌｅｔｅｄ ｉｎ ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ－ｌｉｋｅ）基因是多种物种精子发生的重要调控因子，为探讨该基因在牙鲆（ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）性腺发育分化中的作用，本研究采用同源克隆和ｒａｃｅ技术克隆了牙鲆ｄａｚｌ基因的ｃｄｎａ序列，利用生物信息学方法分析了其序列结构，并利用实时荧光定量ｐｃｒ技术检测了该基因在牙鲆成体组织和早期发育阶段的表达情况。结果发现：牙鲆ｄａｚｌ ｃｄｎａ序列全长２ ０３１ ｂｐ，包括１０５ ｂｐ的５＇端非翻译区，１ ２７５ ｂｐ的３＇端非翻译区和编码２１７个氨基酸残基的６５１ ｂｐ开放阅读框；氨基酸同源序列比对显示该序列存在一个高度保守的ｒ．．．
关键词：
牙鲆 dazl cDNA克隆 基因表达
[期刊] 海洋渔业
[作者]
苏艳芳 付元帅 施志仪 张红梅 高丽娜
采用RACE-PCR技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)组织中克隆了血清应答因子(SRF)基因全长序列,该序列全长2 477 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸。通过氨基酸同源序列比对,牙鲆SRF与其它物种的同源性较高,在氨基酸序列的N端具有NLS结构域和高度保守的MADS结构域。用PCR方法扩增SRF基因的编码区片段,克隆到p EGFP-N1载体中,构建真核表达载体p EGFP-N1-SRF,将重组质粒转染牙鲆胚胎细胞,在荧光显微镜下观察转染细胞有绿色荧光蛋白表达。荧光定量PCR和Western blot实验进一步证实,SRF在转染细胞中高表达。说明...
关键词：
SRF 牙鲆 克隆 真核表达
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
韦芬 何欣慰 鲍宝龙
Ras主要参与表皮生长因子家族调控细胞分裂的信号通路。采用末端快速扩增法获得了牙鲆(Paralichthys olivaceus)ras-2基因全长2 384 bp cDNA序列,该序列编码187个氨基酸,含有switchⅠ、switchⅡ、P-loop、CAAX box等Ras家族的结构特征,与川鲽(Platichthys flesus)ras-2氨基酸序列相似性最高(96.3%)。定量RT-PCR检测显示ras-2基因在牙鲆成体的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、鳃、肠、肌肉、鳍条和皮肤组织均有不同程度的表达,其中鳍条表达量最高,肌肉的表达量最低;在牙鲆变态前和变态初相对表达量较高,随着变态进行,表...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
马慧鑫 王磊 汪林庆 周茜 陈松林
本研究克隆得到牙鲆(Paralichthys olivaceus)精氨酸酶Ⅱ基因(ArginaseⅡ,Arg-Ⅱ)全长cDNA序列,并检测了Arg-Ⅱ在牙鲆免疫组织和细菌感染过程中的时空表达模式。结果显示,Arg-Ⅱ基因cDNA全长1882 bp,包含1050 bp开放阅读框,编码349个氨基酸(预测分子量为38.02 kDa,等电点为6.42)。Arg-Ⅱ基因编码的氨基酸序列具有典型的精氨酸酶结构特征,推测与哺乳动物中的功能类似。系统进化分析显示,鱼类Arg-Ⅱ基因合成一簇,其中,Arg-Ⅱ基因与鲈鱼(Lates calcarifer)相关度最高(93%)。实时荧光定量结果显示,Arg-Ⅱ基因在健康牙鲆的肝、脾和鳃等免疫组织中有较高表达。进一步研究发现,经迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染的牙鲆成鱼中,主要免疫组织中Arg-ⅡmRNA的表达量在细菌感染后6~12 h显著上调,随后表达量恢复正常。离体培养的牙鲆巨噬细胞经迟缓爱德华氏菌感染后,Arg-Ⅱ基因也呈显著上调模式。因此,本研究结果表明,Arg-Ⅱ基因参与牙鲆响应迟缓爱德华氏菌感染的免疫过程,揭示Arg-Ⅱ基因可能在牙鲆抗病免疫中发挥重要作用。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张永珍 陈松林 王磊
趋化因子是一类具有化学趋化功能的小分子分泌性蛋白,能够引导白细胞到损伤或者感染的部位,参与免疫调节和病理反应。为丰富鲆鲽鱼类趋化因子的相关基础研究,本研究克隆了牙鲆(Paralichthys olivaceus)趋化因子基因CXCL9,其全长为910 bp,开放阅读框为408 bp,编码135个氨基酸。该基因具有趋化因子超家族的典型特征,在35、37、60和77个氨基酸位置具有4个保守的半胱氨酸残基,形成两个二硫键。氨基酸序列分析表明,该基因与大菱鲆(Scophthalmus maximus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的CXCL9基因具有较高的同源性,分别为78.5%和71.0%。实时荧光定量PCR结果显示, CXCL9在正常牙鲆肝脏和脾脏中的表达量非常高,在皮肤和鳃等组织中表达量次之,说明CXCL9特异性地在免疫相关组织中表达。经迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA表达量在感染后6 h即出现高峰值,而头肾和脾脏中的高峰值出现较晚。经鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后6 h,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA的表达量升高近8倍,头肾中的表达高峰值出现在感染后24 h,而脾脏中CXCL9 mRNA的表达量在感染后6 h迅速升高10倍,逐渐降低后48 h又出现高峰,为正常水平的20倍。上述研究结果说明CXCL9基因在病原菌感染过程中有快速响应,可能参与了免疫防御过程,将有可能发展为一种牙鲆细菌性疾病的生物标记。本研究为牙鲆趋化因子超家族免疫机制的深入研究奠定了基础。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
高丽娜 付元帅 施志仪 苏艳芳 张红梅
通过ＰＣＲ技术，从牙鲆（ＰａＲａｌｉＣｈｔｙｓ ｏｌｖａＣｅｕｓ）总ＲＮａ中获得牙鲆ｌｉＮ－２９基因Ｃ ＤＮａ序列，该序列全长１ ７６９ ｂＰ，包括１ ３２９ ｂＰ开放阅读框，编码４４２个氨基酸，预测其是一种多锌指结构蛋白；氨基酸序列对比分析显示，牙鲆ｌｉＮ－２９与大黄鱼（ｌａＲｉｍｉＣｈｔｈｙｓ ＣＲｏＣｅａ）的同源性最高，达９５．２５％；系统进化树分析表明，牙鲆与其他鱼类聚集一支，并且与罗非鱼的进化关系最近。荧光定量ＰＣＲ显示，在牙鲆胚胎和仔鱼发育阶段，以原肠胚期ｌｉＮ－２９表达量最高；组织表达分析表明，脑中表达最高，肌肉中最低。外源甲状腺激素（ｔｈ）在牙鲆仔鱼发育初期（ｔｈ处理后２ Ｄ、．．．
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
柳学周 臧坤 徐永江 李春广 史宝 王妍妍
利用cDNA末端快速克隆(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)方法获得了漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)促黄体素(Luteinizing Hormone,LH)β亚基的cDNA全长序列,检测了LHβ亚基mRNA的组织表达水平,揭示了垂体、肝脏和卵巢中LHβ亚基mRNA在卵巢发育周期中的表达水平变化,利用酶联免疫技术(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)测定了血浆LH和雌二醇(Estrodiol,E2)表达水平的变化。结果表明,漠斑牙鲆为卵巢非同步发育分批产卵性鱼类,LHβ亚基cDN...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
陈新页 郭华 鲍宝龙
鱼类主要通过视蛋白来感知光强和波长。本研究首次克隆到牙鲆(Paralichthys olivaceus)短波紫外敏感视蛋白SWS1基因全长cD NA序列共1 317 bp,包括含1 077 bp的开放阅读框,编码蛋白358个氨基酸,表明牙鲆仔鱼具有潜在感知紫外线的能力。此外,qR T-PCR显示视杆视蛋白RH1和SWS1基因表达无显著性变化;而中波敏感视蛋白RH2和短波蓝色敏感视蛋白SWS2基因表达从孵化后第1天到第13天显著性增强;长波敏感视蛋白LWS基因从孵化后第1天到第6天显著性增强,而此后到第13天显著性降低。RNA整体原位杂交显示,眼睛中感蓝光的SWS2基因表达较其他视蛋白基因晚。视...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
侯吉伦 郭亚男 付元帅 王桂兴 张晓彦 孙朝徽 司飞 王玉芬
为在分子水平解析牙鲆(Paralichthys olivaceus)抗淋巴囊肿病的机理,本研究克隆牙鲆淋巴囊肿抗病免疫相关基因efhd2和tbc1d25的c DNA全序列,运用生物信息学方法对基因序列进行了详细分析;同时,采用荧光定量PCR分析了efhd2和tbc1d25基因在牙鲆胚胎发育不同阶段、淋巴囊肿抗病和患病个体不同组织的表达特征。结果显示,efhd2基因c DNA全长为5231 bp,开放阅读框(ORF)长为699 bp,编码232个氨基酸。tbc1d25基因c DNA全长为3173 bp,ORF长为2601 bp,编码866个氨基酸。定量结果显示,efhd2和tbc1d25基因在胚胎发育的各个时期均有不同程度的表达,其中,efhd2在出膜仔鱼期表达量最高,而tbc1d25在受精卵中的表达量显著高于其他时期(P<0.05)。在所研究的淋巴囊肿抗病和患病个体不同组织中,efhd2和tbc1d25基因均有不同程度的表达,抗病个体的血液中,这2个基因的表达量均显著高于患病个体(P<0.05)。本研究结果为深入探讨efhd2和tbc1d25基因功能和解析牙鲆淋巴囊肿抗病机理提供了基础资料。
关键词：
淋巴囊肿 抗病机理 血液 胚胎发育
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
刘晓飞 张爽爽 Endri Hendriansyah 李英瑞 苏琳 李相前 修云吉 顾伟
半乳糖凝集素6 (Galectin-6)是β-半乳糖苷结合凝集素家族的成员之一，本研究首次分离并鉴定了牙鲆(Paralichthys olivaceus) Galectin-6 (PoGalectin-6)，分析了其分子特征和表达模式，并对其免疫相关功能进行了研究。PoGalectin-6基因的开放阅读框长为1089 bp，共编码362个氨基酸，其中包含2个糖识别结构域(CRDs)。同源序列比对和系统进化树分析显示，PoGalectin-6与大菱鲆(Scophthalmus maximus) Galectin-4的相似性为80.9%。组织分布结果显示，PoGalectin-6基因主要在肠组织中特异性表达。迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后，PoGalectin-6基因在肠组织中的表达显著升高，感染后12 h表达量最高，随后逐渐降低并恢复至正常水平。细菌结合实验证实，PoGalectin-6重组蛋白(rPoGalectin-6)能够结合枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、迟缓爱德华氏菌和创伤弧菌(Vibrio vulnificus)，但并不结合短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。此外，rPoGalectin-6以钙离子依赖的方式对短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、杀鲑气单胞菌和迟缓爱德华氏菌表现出明显的凝集作用。研究表明，PoGalectin-6基因参与了由迟缓爱德华氏菌感染引起的免疫应答，这一发现为探索Galectin-6在硬骨鱼类中的免疫功能奠定了基础。
[期刊] 水产学报
[作者]
鲍宝龙 杨桂梅 施志仪 任大明
为了克隆变态早期牙鲆头部差异表达的基因,采用抑制差减杂交法,以变态前的仔鱼头部表达的RNA作为驱动RNA,建立了牙鲆变态早期的差减cDNA文库,并利用相对定量RT-PCR对其进行了筛选。差减库的平均插入片段558bp左右,阳性率为81.8%。随机测定的45个克隆,在剔除假阳性克隆后,共得到22个不同的基因,其中13个为已知cDNA的同源基因,而另外9个为已知蛋白的同源基因,分别为prolactin receptor-like,COL1A1,M-3muscarinic receptor,Sfrs3,tropomyosin,ribosomal protein L27,ribosomal prote...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
张子威 王磊 李开敏 卢昇 郑卫卫 陈松林
迟缓爱德华氏菌病是海水鲆鲽鱼类的主要病害，发掘抗病分子标记辅助育种是十分有效的策略。本研究以牙鲆(Paralichthys olivaceus) rnd1基因(Pornd1)为对象，对该基因在牙鲆抗病免疫方面的作用进行系统分析。首先对Pornd1基因进行克隆鉴定和抗病相关单核苷酸多态性位点的定位。利用荧光定量PCR对Pornd1基因的组织分布、细菌感染后表达情况以及在抗病和易感家系中的表达水平进行检测。结果显示，Pornd1 cDNA开放阅读框为699 bp，编码232个氨基酸。结合前期GWAS分析数据，本研究对Pornd1基因扩增和测序，确定Pornd1基因内含子2上存在一个抗迟缓爱德华氏菌病相关单核苷酸多态性位点，该位点在易感家系和抗病家系中分别是C/T，抗病家系(freq_(T)=0.92)高于易感家系(freq_(T)=0.20)，具有显著性差异(P
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