甲状腺激素T3在鱼类胚后发育与变态发育过程中发挥着重要作用,甲状腺激素T4通过Ⅰ型甲状腺氨酸脱碘酶(Dio1)生成T3,因此,调查Dio1基因在胚后发育包括变态发育过程中原位表达谱,有助于理解T3在胚后发育中的具体作用。利用RNA整体原位杂交技术,发现Dio1主要在牙鲆肠道、鳃、肝、肌肉、鳍、眼睛周围等器官和组织表达,鳃、肠道、奇鳍中的Dio1原位表达谱有一定的规律性,尤其在生骨肌细胞向鳍褶中迁移、臀鳍和背鳍(包括冠状幼鳍)的鳍条和支鳍骨的发生过程中,Dio1可能通过影响这些组织器官的T3水平而发挥重要作用。

细胞分裂在鲽形目鱼类变态过程中发挥了重要作用。Epigen作为表皮分裂原,通过激活MAPK通道来调控有丝分裂。以前的研究利用定量PCR表明,epigen在变态前期表达量升高,而变态后期表达量下降,表明其与变态发育相关。为了进一步调查epigen与牙鲆变态发育的关系,利用RNA整体原位杂交技术检测了epigen在变态期牙鲆体内的空间表达分布,发现在变态期的各个阶段,epigen基因表达分布均比较广泛,表皮、鳃、肝脏、肠道、鳍条、支鳍骨、肌节等组织都有表达,在牙鲆变态前和变态早期(E期)信号较强,而在变态高峰期(F期和G期)和变态后期(H期)信号逐渐变弱。Epigen空间表达分布模式提示,其作为表...

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)可通过调节染色质结构和抑制特异性转录因子活性来调控细胞生长和分化。鉴于HDACs在蝌蚪变态发育过程中的作用,本研究克隆了牙鲆(Paralichthys olivaceus)HDAC1基因全长cDNA序列,并调查了其在牙鲆变态前和变态阶段的空间表达。牙鲆HDAC1全长cDNA序列为2 540 bp,包含长度为126 bp的5'UTR,1 470 bp的ORF和944 bp的3'UTR。HDAC1基因在牙鲆变态前以及变态阶段均有表达,这和蝌蚪中仅在变态前表达的现象不同。HDAC1在冠状幼鳍上的表达是随着幼鳍原基的生长发育逐渐增强的,直至冠状幼鳍分化成形后,基因表达减弱...

胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factor Ⅰ,IGF-Ⅰ)是脊椎动物生长发育的重要调控因子,其生物学功能主要通过与其特异的膜受体(IGF-Ⅰ receptor,IGF-IR)结合而调节。因此,IGF-Ⅰ及其受体表达特征的分析对于阐述IGF系统调控的发育过程具有重要的意义。本研究采用荧光实时PCR方法,以不同发育时期的牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎为材料,分析了胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)及其两种受体基因在鱼类胚胎发育过程中的表达图式。结果显示,牙鲆IGF-Ⅰ、IGF-IR-1和IGF-IR-2基因均有母源转录本,且各基因的表达在...

为了调查表皮细胞分裂原epigen基因是否与牙鲆变态发育有关,分析了从变态期牙鲆仔鱼cDNA文库中测序得到的epigen基因。发现epigen基因编码162个氨基酸,具有信号肽序列,一个跨膜结构域和EGF-like结构域。EGF-like结构域包含有可形成3个二硫键的6个半胱氨酸残基,是表皮生长因子家族的结构特征。此外,利用荧光实时定量RT-PCR,调查了epigen基因在牙鲆眼睛移动过程中的变化。相比眼睛移动之前(17DAH,day after hatching),epigen基因在眼睛移动初期(19DAH)表达明显增强,为17DAH时的2.363倍;而在眼睛移动过程的高峰期(23DAH),...

MicroRNAs(miRNAs)通过抑制编码基因的转录调控关键的生物学进程。研究发现,let-7是时序发育过程中的重要调控因子,在促进幼体向成体转变的发育过程中起着极其重要的作用。利用Solexa测序技术从牙鲆中成功鉴定出let-7家族的10个成员((let-7a,let-7b,let-7c,let-7d,let-7e,let-7f,let-7g,let-7h,let-7i,let-7j)。相对于let-7家族其他成员,let-7d的拷贝数最多,推测其在牙鲆发育过程中扮演着更重要的角色。运用实时荧光定量PCR方法分析let-7d在牙鲆变态发育不同时期的表达,结果发现,在对照组和甲状腺激素处理...

抗菌肽hepcidin是由hepcidin基因编码产生的小分子多肽,是机体天然免疫的重要因子。本文利用RT-PCR的方法分析表明,抗菌肽hepcidin基因在牙鲆成鱼不同组织和不同发育时期胚胎中普遍表达,但是表达水平存在着明显的差异。

通过ＰＣＲ技术，从牙鲆（ＰａＲａｌｉＣｈｔｙｓ ｏｌｖａＣｅｕｓ）总ＲＮａ中获得牙鲆ｌｉＮ－２９基因Ｃ ＤＮａ序列，该序列全长１ ７６９ ｂＰ，包括１ ３２９ ｂＰ开放阅读框，编码４４２个氨基酸，预测其是一种多锌指结构蛋白；氨基酸序列对比分析显示，牙鲆ｌｉＮ－２９与大黄鱼（ｌａＲｉｍｉＣｈｔｈｙｓ ＣＲｏＣｅａ）的同源性最高，达９５．２５％；系统进化树分析表明，牙鲆与其他鱼类聚集一支，并且与罗非鱼的进化关系最近。荧光定量ＰＣＲ显示，在牙鲆胚胎和仔鱼发育阶段，以原肠胚期ｌｉＮ－２９表达量最高；组织表达分析表明，脑中表达最高，肌肉中最低。外源甲状腺激素（ｔｈ）在牙鲆仔鱼发育初期（ｔｈ处理后２ Ｄ、．．．

通过PCR技术,从牙鲆(Paralichtys olvaceus)总RNA中克隆了牙鲆Dicer基因序列,该序列全长6 585bp,包括5 691 bp的开放阅读框,编码1 896个氨基酸。在多个物种间的蛋白序列对比中,牙鲆Dicer与其它物种的同源性平均高达78%,与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)同源性最高达到89%;在进化树分析中,牙鲆Dicer与其它鱼类Dicer聚集一支。荧光定量PCR显示,牙鲆Dicer基因在牙鲆大脑里的表达最高。同样的,在牙鲆胚胎和仔鱼早期发育阶段里也发现了相对高水平的Dicer mRNA表达。在用甲状腺激素(TH)处理过程中发现,牙鲆Di...

本研究利用实验室已建牙鲆(Paralichthys olivaceus)转录组数据库预测得到牙鲆NOD2基因(PoNOD2),并利用PCR技术进行序列验证。同时,设计迟缓爱德华氏菌注射感染牙鲆成鱼和体外免疫刺激牙鲆鳃细胞系实验,探究PoNOD2基因在抗菌免疫反应中的作用。PoNOD2基因的开放阅读框长度为2964 bp,编码988个氨基酸。PoNOD2蛋白有3种保守结构域,包括C-末端LRR,中心NACHT和N-末端CARD结构域。实时荧光定量PCR结果显示,在所检测牙鲆组织中,迟缓爱德华氏菌的侵染能显著上调PoNOD2的表达。体外免疫刺激牙鲆鳃细胞系实验显示,在PGN、PolyⅠ:C和迟缓爱德华氏菌刺激下,PoNOD2表达上调。亚细胞定位显示,PoNOD2蛋白定位于牙鲆鳃细胞的细胞质中。在迟缓爱德华氏菌侵染牙鲆鳃细胞过程中,PoNOD2基因的过表达能够抑制细菌生长,并引起IL-1β、IL-6和IL-8等炎性细胞因子的表达上调。结果表明,PoNOD2在抑制迟缓爱德华氏菌生长以及调节牙鲆对病原菌的免疫应答中发挥重要作用。

利用cDNA末端快速克隆(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)方法获得了漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)促黄体素(Luteinizing Hormone,LH)β亚基的cDNA全长序列,检测了LHβ亚基mRNA的组织表达水平,揭示了垂体、肝脏和卵巢中LHβ亚基mRNA在卵巢发育周期中的表达水平变化,利用酶联免疫技术(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)测定了血浆LH和雌二醇(Estrodiol,E2)表达水平的变化。结果表明,漠斑牙鲆为卵巢非同步发育分批产卵性鱼类,LHβ亚基cDN...

为了探讨甲状腺激素受体TRαA基因在牙鲆不同变态发育阶段中的表达差异,以及甲状腺激素T4和硫脲处理对TRαA基因表达的影响,采用了半定量RT-PCR法测定牙鲆不同发育阶段头部甲状腺激素受体TRαA mRNA水平。结果显示,牙鲆不同变态发育阶段甲状腺激素受体TRαA基因表达存在明显差异,从受精卵到变态期TRαA表达量呈缓慢增加趋势,到24日龄出现第一个表达高峰,随后表达量下降,30日龄之后随日龄增加表达量又逐渐增加,至变态高峰期38日龄出现第二个表达高峰,而且高于第一个表达高峰,至成鱼表达量再次下降至较低水平。甲状腺激素T4处理组和硫脲处理组与同日龄正常组相比,TRαA的表达也有明显差异,在甲状...

【目的】前期已对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)7日龄工蜂中肠(Am7)、10日龄工蜂中肠(Am10)进行全转录组测序,本研究基于高质量的组学数据探究中肠发育过程中的差异基因表达谱及其调控网络,以期解析意蜂工蜂中肠发育的分子机理。【方法】根据FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)算法计算基因表达量,并以|log2 fold change|≥1且P≤0.05作为标准筛选得到差异表达基因(differentially expressed gene,DEG)。利用TargetFinder软件预测ame-miR-6001-3p的靶mRNA。利用相关生物信息学软件,对全部DEG进行GO和KEGG数据库注释。筛选出与AMPK、P13K-Akt、Wnt、cAMP、FoxO、Hippo、mTOR、Jak-STAT、Toll-like受体、TGF-beta、Notch、MAPK和NF-κB 13条信号通路存在富集关系的DEG,以及与ame-miR-6001-3p存在靶向结合关系的DEG,通过Cytoscape软件构建调控网络将其富集关系与调控关系可视化。利用茎环反转录PCR(Stem loop RT-PCR)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证ame-miR-6001-3p以及DEG在Am7和Am10中的差异表达情况。【结果】Am7 vs Am10比较组中共有1 038个DEG,包括515个上调基因和523个下调基因。这些DEG涉及细胞进程、代谢进程和催化活性等功能条目,并显著富集在氧化磷酸化、氨基糖与核苷酸糖代谢、脂肪酸代谢和嘌呤代谢等能量和物质代谢通路,表明工蜂中肠内存在旺盛细胞生命与新陈代谢活动。表达量聚类分析发现分别有20、18、15和14个DEG富集在AMPK信号通路、P13K-Akt信号通路、内吞作用和Hippo信号通路。57个DEG与P13K-Akt、Wnt、Jak-STAT等上述13条与生长发育和免疫防御相关的信号通路存在富集关系,且1个DEG可与多条信号通路存在富集关系。调控网络分析结果显示,分别有54个上调基因和44个下调基因可被ame-miR-6001-3p靶向结合;上调基因富集在磷酸肌醇代谢、胰岛素信号通路、Hippo信号通路和谷胱甘肽代谢等43条代谢通路,而下调基因富集在Hippo信号通路、新陈代谢途径、谷胱甘肽代谢和花生四烯酸代谢等20条代谢通路。RT-qPCR结果显示随机挑选的6个DEG的表达量变化趋势与测序数据一致,证实了本研究中基因差异表达真实可靠。此外ame-miR-6001-3p在Am7和Am10内均真实表达,并在Am10中的相对表达量显著较低。【结论】对意蜂工蜂中肠发育过程的DEG表达谱和DEG与ame-miR-6001-3p之间的调控关系,以及DEG的潜在作用进行深入分析和探讨,发现DEG可参与TGF-beta、Wnt、Hippo、Notch、PI3K-Akt、mTOR、AMPK和NF-κB等各类信号通路进而影响中肠的生长发育和免疫防御,DEG可通过与显著下调表达的ame-miR-6001-3p形成复杂的调控网络参与意蜂工蜂中肠发育过程中胰岛素信号通路等多条代谢途径。