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[期刊] 华北农学报
[作者]
陈晓武 施志仪 李倩 江山
抗菌肽是鱼类先天免疫的组成部分,发现新的抗菌肽对于动物抗病机理的研究和寻找新药物有重要意义。经过对GenBank数据库中牙鲆EST文库进行同源比对后,筛选得到一个具有完整编码框的抗菌肽cDNA序列,结果再经过RT-PCR进行验证,命名为LEAP-2,对该序列进行注释,获得序列登录号EU586111。该抗菌肽能编码102个氨基酸的多肽,前28个氨基酸组成信号肽。推测编码蛋白质分子量为11 276.9 u,理论等电点(PI)为9.33。其蛋白质序列与另外9种鱼类的同源抗菌肽序列比较发现,同源性介于38.2%～61.7%。其中57至92位氨基酸为高度保守区,是维持其空间结构的主要区域,其中包含有4个...
关键词：
牙鲆 肝抗菌肽2 序列分析 同源建模
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
徐倩 王宁宁 白莉 史鲲鹏 沙珍霞
肝脏表达抗菌肽2 (liver-expressed antimicrobial peptide 2， LEAP-2)在鱼类先天免疫系统中发挥重要作用。本研究通过RACE技术获得了俄罗斯鲟LEAP-2 (Acipenser gueldenstaedti LEAP-2， AgLEAP-2)的全长cDNA序列，对其序列特征和表达水平进行了分析；构建AgLEAP-2原核表达载体并对重组蛋白进行纯化；进一步采用琼脂稀释法初步检测AgLEAP-2蛋白的抑菌活性。结果显示，AgLEAP-2基因cDNA全长为622 bp，开放阅读框(open reading frame， ORF)为246 bp，预测编码81个氨基酸，分子量约为11.2 kDa，5′端非编码区为184 bp，3′端非编码区为192 bp。AgLEAP-2包含一个信号肽(1～25 aa)和一个成熟肽(26～81 aa)，成熟肽含有4个保守的半胱氨酸残基，在Cys58-Cys69和Cys64-Cys74的相对位置之间各形成一个二硫键的核心结构。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)结果显示，AgLEAP-2在所有健康组织中广泛表达，在肝脏中表达水平最高，在肠道和肌肉中表达水平次之，在鳃中表达量最低。与0 h相比，AgLEAP-2在感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后的不同时间点的肝脏、脾脏、肠道、头肾、鳃和血液组织中均显著上调。此外，重组AgLEAP-2 (rAgLEAP-2)蛋白在体外对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有抗菌活性并存在剂量效应。本研究表明，AgLEAP-2可能在俄罗斯鲟的先天免疫系统中发挥重要作用且对多种病原菌有一定的抗菌效果，本研究为开发新的抗菌制剂提供了依据。
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
杨绒 陈松林 李伟 王志坚
抗菌肽hepcidin是由hepcidin基因编码产生的小分子多肽,是机体天然免疫的重要因子。本文利用RT-PCR的方法分析表明,抗菌肽hepcidin基因在牙鲆成鱼不同组织和不同发育时期胚胎中普遍表达,但是表达水平存在着明显的差异。
[期刊] 华北农学报
[作者]
张元臣 胡梦杰 薛爽 郭文军 沈红 王景顺
利用反转录PCR(RT-PCR)和末端快速扩增(RACE)技术从三龄黏虫体内获得新型抗菌肽Diapausin基因的全长序列，利用生物信息学软件对该序列进行分析，并用原核表达体系对其进行诱导表达，为探究该基因的结构和功能提供理论参考。结果表明，成功克隆到了黏虫新型抗菌肽Diapausin基因，命名为Mysdiap(GenBank登录号：AZJ51075)。该基因全长537 bp,其中5′端和3′端非编码区分别为63,279 bp,开放阅读框全长195 bp,编码64个氨基酸残基，预测蛋白质分子质量为7.13 ku,等电点为5.59。Mysdiap的N端前24个氨基酸残基为信号肽序列。多重联配结果表明，Mysdiap氨基酸序列中具有高度保守区域ECCRAHG。成功构建了pET-Mysdiap重组表达质粒，并在大肠杆菌中用IPTG诱导其表达，表达的重组蛋白分子质量在20 ku左右，以包涵体和可溶性蛋白形式存在。综上，从黏虫中克隆获得了新型抗菌肽基因Mysdiap的全长序列，并在大肠杆菌中成功诱导其表达。
[期刊] 水产学报
[作者]
张果苹 汪桂玲 郭诗照 白志毅 李家乐
采用RACE方法,克隆了背角无齿蚌抗菌肽theromacin基因的cDNA全序列。结果显示,该cDNA序列全长为870 bp,5'端非翻译区104 bp,3'端非翻译区460 bp,开放阅读框长为306 bp,共编码101个氨基酸,相对分子量为11 166.9 u。同源性分析显示,该基因编码的蛋白与三角帆蚌theromacin基因氨基酸序列的相似度最高,为73%;与贻贝中发现的抗菌肽defensins、mytilins、myticins和mytimycins等4种类型相似度较低,属于Macin家族(登录号:KJ598604)。实时荧光定量PCR分析结果显示,该基因在血液、肝脏、外套膜、鳃、斧足...
[期刊] 水产学报
[作者]
廖智 刘梅 王日昕 武梅 杨丽佳 鲁涛 徐田军 石戈
抗菌肽是贻贝免疫系统中的一个重要组成部分,也是目前海洋生物抗菌肽研究的重要内容。在贻贝抗菌肽家族中,mytilin和myticin是目前贻贝抗菌肽研究中发现成员最多,丰度最高的两个家族,在贻贝免疫系统中占有重要的地位。为了解厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin的基因组成及其多样性机制,通过设计特异性引物,以厚壳贻贝血细胞cDNA文库为模板进行PCR扩增以筛选文库,共克隆到8条mytilin的同源cDNA序列和9条myticin的同源cDNA序列,并对其基因序列及推导的氨基酸序列进行了序列比对和变异位点初步分析。上述研究为将来深入研究厚壳贻贝的免疫机制及筛选具有开发价值的抗菌肽分子奠定了...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王辉 郧海丽 赵军锋 王多 冉然 胡玉红
为了从生物体中寻找新颖的抗菌肽类药物分子,以阔褶水蛙(Hylarana latouchii)为研究材料,运用3′RACE技术成功从其皮肤组织中筛选出2个抗菌肽前体cDNA编码序列,经blast生物信息学分析,确定其为首次发现,推导出的这2条新颖的抗菌肽序列,命名为latouchiin-1和latouchiin-2。
关键词：
阔褶水蛙 抗菌肽 分子克隆 皮肤组织
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
李伟 孙文秀 熊涛
根据已知鱼类抗菌肽hepcidin的同源性设计简并引物,利用同源克隆结合RACE法从黄鳝(Monopterus albus)肝脏中扩增得到了黄鳝hepcidin基因全长cDNA序列(GenBank accession number FJ436808).结果表明,黄鳝hepcidin基因cDNA全长712bp,5′端非翻译区有133bp,3′端非翻译区有306bp,包含1个273bp的开放阅读框,编码1个长90氨基酸的前体肽.同源性分析表明,黄鳝hepcidin推测的氨基酸序列与其他鱼类报道的hepcidin具有较高的同源性,并具有8个半胱氨酸这一典型特征,是hepcidin家族的1个新成员.采...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
曹丹丹 刘金相 王志刚 张全启 齐洁 王旭波 于海洋
本研究利用实验室已建牙鲆(Paralichthys olivaceus)转录组数据库预测得到牙鲆NOD2基因(PoNOD2),并利用PCR技术进行序列验证。同时,设计迟缓爱德华氏菌注射感染牙鲆成鱼和体外免疫刺激牙鲆鳃细胞系实验,探究PoNOD2基因在抗菌免疫反应中的作用。PoNOD2基因的开放阅读框长度为2964 bp,编码988个氨基酸。PoNOD2蛋白有3种保守结构域,包括C-末端LRR,中心NACHT和N-末端CARD结构域。实时荧光定量PCR结果显示,在所检测牙鲆组织中,迟缓爱德华氏菌的侵染能显著上调PoNOD2的表达。体外免疫刺激牙鲆鳃细胞系实验显示,在PGN、PolyⅠ:C和迟缓爱德华氏菌刺激下,PoNOD2表达上调。亚细胞定位显示,PoNOD2蛋白定位于牙鲆鳃细胞的细胞质中。在迟缓爱德华氏菌侵染牙鲆鳃细胞过程中,PoNOD2基因的过表达能够抑制细菌生长,并引起IL-1β、IL-6和IL-8等炎性细胞因子的表达上调。结果表明,PoNOD2在抑制迟缓爱德华氏菌生长以及调节牙鲆对病原菌的免疫应答中发挥重要作用。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
钟万福 李加琪 杨承忠 王翀 张豪 张爱玲
【目的】克隆仙湖肉鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的cDNA,并进行组织表达谱和蛋白结构分析,为肉鸭的分子育种提供基础资料。【方法】通过比较基因组学,采用RT-PCR和RACE技术,获得了Lb-FABP基因的cDNA序列全长序列;并采用半定量PCR分析了Lb-FABP基因在16个组织的表达;通过生物信息学方法预测了Lb-FABP基因的蛋白结构。【结果】仙湖肉鸭Lb-FABP基因的cDNA全长548bp,包括97bp长的5′非翻译区(5′UTR)和70bp长的3′非翻译区(3′UTR)以及381bp开放阅读框(ORF,含终止密码子)。Lb-FABP基因组序列包括4个外显子和3个内含子...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
韦芬 何欣慰 鲍宝龙
Ras主要参与表皮生长因子家族调控细胞分裂的信号通路。采用末端快速扩增法获得了牙鲆(Paralichthys olivaceus)ras-2基因全长2 384 bp cDNA序列,该序列编码187个氨基酸,含有switchⅠ、switchⅡ、P-loop、CAAX box等Ras家族的结构特征,与川鲽(Platichthys flesus)ras-2氨基酸序列相似性最高(96.3%)。定量RT-PCR检测显示ras-2基因在牙鲆成体的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、鳃、肠、肌肉、鳍条和皮肤组织均有不同程度的表达,其中鳍条表达量最高,肌肉的表达量最低;在牙鲆变态前和变态初相对表达量较高,随着变态进行,表...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王辉 张秀清 胡玉红 刘敬兰 孙君社
运用SMART技术成功构建了阔褶水蛙(Hylarana latouchii)皮肤组织全长cDNA文库,用来筛选抗菌肽及其他功能性基因。经鉴定,原始文库滴度为9.7×106cfu/mL,重组率达到91%,插入片段大小在0.3~1.5 kb范围内,文库扩增后的滴度为1.9×109cfu/mL,说明所构建文库质量较高。通过该文库成功筛选出2个抗菌肽cDNA序列,此序列属于brevinin-2家族,因此命名为brevinin-2LT1和brevinin-2LT2。
关键词：
阔褶水蛙 cDNA文库 抗菌肽 文库滴度
[期刊] 水产学报
[作者]
张东玲 关瑞章 黄文树 熊静 徐继松 宋宝东
为了能够快捷地分离纯化出单一的抗菌肽,实验采用不同pH值(离子交换流动相pH3.0、4.0、5.0;反相液相层析流动相pH 2.0、4.5、7.0)缓冲液,不同色谱柱(离子交换和凝胶过滤层析柱分别与反相液相层析柱)联用对日本鳗鲡肝脏抗菌肽分离纯化效果进行了比较,并分析了琼脂板扩散法和微孔液体培养法检测抗菌活性的优缺点。结果显示:pH 4.0缓冲液为最佳离子交换流动相,蛋白提取率为16.43%,得到2个洗脱峰;反相液相层析3种pH缓冲液分离效果均不理想,凝胶过滤层析柱与反相液相层析柱联用能明显改善日本鳗鲡肝脏抗菌肽分离纯化效果,洗脱峰数量较多,峰形单一且尖锐狭窄,基线平而低。琼脂板扩散法检测抗菌...
关键词：
日本鳗鲡 抗菌肽 pH 色谱柱 抗菌活性
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
司瑜 王宣刚 王梦娅 王欣桐 于海洋 张全启 王志刚
本研究利用实验室已建牙鲆(Paralichthysolivaceus)转录组数据库,得到牙鲆JNK2基因(Po JNK2)并利用PCR技术进行序列验证。PoJNK2的开放阅读框长度为1263 bp,编码420个氨基酸;通过SMART服务器对PoJNK2的结构域进行预测,显示PoJNK2具有典型的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶催化结构域S_TKc。利用q RT-PCR分析PoJNK2在牙鲆成体不同组织中的表达水平,发现其在牙鲆免疫组织中均有表达,因此,初步推测PoJNK2在牙鲆免疫应答方面可能发挥作用。本研究设计了体内迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)侵染实验和体外免疫刺激细胞实验以探究PoJNK2在牙鲆免疫反应中的作用。在迟缓爱德华氏菌体内注射牙鲆成体后,PoJNK2在脾脏、头肾和鳃中有不同程度的表达上调。同时,使用迟缓爱德华氏菌、Poly I:C和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激牙鲆鳃细胞系后,发现PoJNK2在不同时间点表达上调。除此之外,通过细胞转染实验在牙鲆鳃细胞系中过表达PoJNK2,发现其对下游炎症细胞因子的表达及激活蛋白Activator protein-1 (AP-1)的转录活性具有显著的上调作用,进一步阐明了PoJNK2在调节牙鲆免疫应答方面的作用。
关键词：
牙鲆 JNK2 迟缓爱德华氏菌 先天免疫
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
侯吉伦 郭亚男 付元帅 王桂兴 张晓彦 孙朝徽 司飞 王玉芬
为在分子水平解析牙鲆(Paralichthys olivaceus)抗淋巴囊肿病的机理,本研究克隆牙鲆淋巴囊肿抗病免疫相关基因efhd2和tbc1d25的c DNA全序列,运用生物信息学方法对基因序列进行了详细分析;同时,采用荧光定量PCR分析了efhd2和tbc1d25基因在牙鲆胚胎发育不同阶段、淋巴囊肿抗病和患病个体不同组织的表达特征。结果显示,efhd2基因c DNA全长为5231 bp,开放阅读框(ORF)长为699 bp,编码232个氨基酸。tbc1d25基因c DNA全长为3173 bp,ORF长为2601 bp,编码866个氨基酸。定量结果显示,efhd2和tbc1d25基因在胚胎发育的各个时期均有不同程度的表达,其中,efhd2在出膜仔鱼期表达量最高,而tbc1d25在受精卵中的表达量显著高于其他时期(P<0.05)。在所研究的淋巴囊肿抗病和患病个体不同组织中,efhd2和tbc1d25基因均有不同程度的表达,抗病个体的血液中,这2个基因的表达量均显著高于患病个体(P<0.05)。本研究结果为深入探讨efhd2和tbc1d25基因功能和解析牙鲆淋巴囊肿抗病机理提供了基础资料。
关键词：
淋巴囊肿 抗病机理 血液 胚胎发育
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