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[期刊] 中国水产科学
[作者]
王旭波 张全启 齐洁 王志刚 王兴莲
对传代296次的牙鲆(Paralichthys olivaceus)鳃细胞系(FG)进行染色体制备和组型分析,并与牙鲆活体鳃细胞组型进行比较。牙鲆活体鳃细胞染色体数目为48,且均为端部着丝粒染色体,染色体组型公式为2n=48,48t,NF=48。而鳃细胞系的染色体数目出现较大变化,有两个分布区间,一个区间是53~79;另一个是119~139。其模式染色体数为68,在模式细胞分裂相中,有30对端部着丝粒染色体和4对中部着丝粒染色体;染色体条数在119以上的分裂相中,除了有很多中部着丝粒染色体以外,小染色体也以很高的频率出现。通过上述研究分析表明,牙鲆鳃细胞系经多次传代后,其染色体与活体鳃细胞染色...
关键词：
牙鲆 细胞系 染色体 组型
[期刊] 水产学报
[作者]
樊廷俊 史振平
利用PEG介导的细胞融合方法 ,将已成系的牙鲆鳃细胞与中国对虾淋巴细胞进行细胞杂交 ,对所获得的杂交细胞用MEM∶MPS( 1∶1)混合培养液进行体外培养。培养 5天后发现 ,杂交细胞长成了单层 ,传代培养后仍可继续生长和分裂。通过逐渐提高混合培养液中MPS的所占比例所筛选出的杂交细胞 ,目前已传 12代 ,生长和分裂势头仍然十分旺盛。通过接种对虾杆状病毒发现 ,10天后杂交细胞出现了明显的病变特征 (细胞收缩变圆、脱落、死亡 ) ,至 14天细胞便几乎完全脱壁死亡。取病变细胞的培养上清 0 .3mL再加入到一瓶已长成单层的杂交细胞中 ,结果 5天后杂交细胞也出现了明显的病变特征 ,而未接种病...
关键词：
牙鲆 中国对虾 杂交细胞 体外培养
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王宣刚 孔祥福 王欣桐 李恒顺 刘金相 王志刚 于海洋
牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国重要的海水增养殖鱼类，先天性免疫在其抵抗外界病原体入侵中发挥重要作用。巨噬细胞作为先天性免疫过程的重要组成部分，在鱼类免疫应答中扮演重要角色。巨噬细胞一般无法传代培养，因此，建立高效的巨噬细胞分离及原代培养技术显得尤为重要。本研究使用密度梯度离心法从牙鲆头肾中分离得到了巨噬细胞，通过差速贴壁法对获得的细胞进行纯化，后续经过优化培养条件和培养过程，采用L-15培养基(Gibco)、5%胎牛血清、1%青–链霉素、1%非必需氨基酸、30% L929细胞培养基在24℃、无CO_(2)的条件下进行培养，显微镜观察及吉姆萨染色结果显示，贴壁细胞具备巨噬细胞形态特征，使用巨噬细胞特异性基因标记mpeg1基因对细胞进行鉴定，结果显示，在分离得到的细胞中成功扩增出该基因。本研究建立了牙鲆巨噬细胞分离和培养技术，为体外研究巨噬细胞功能、深入了解硬骨鱼先天性免疫奠定了基础。
关键词：
牙鲆 巨噬细胞 原代培养 鉴定
[期刊] 中国水产科学
[作者]
任国诚 陈松林 沙珍霞
漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)是中国近年新开发的重要海水养殖鱼类,本研究以漠斑牙鲆囊胚期胚胎为材料,探索了鱼类胚胎细胞分离和培养的条件,建立了漠斑牙鲆胚胎细胞培养技术。建立的漠斑牙鲆胚胎细胞系(SFEC)至今已经培养了240多天,传至80多代。SFEC的完全培养基采用添加抗生素、胎牛血清(FBS)、花鲈血清(SPS)、成纤维生长因子(bFGF)的DMEM。SFEC形态小而呈圆形、多边形,在培养基中生长迅速。本实验检测了温度、胎牛血清浓度、成纤维生长因子对SFEC生长的影响。在24~30℃之间SFEC生长良好,但当温度低于18℃时细胞生长速度明显减慢。在含15%FB...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
俞海洋 杜昕昕 常彦红 王旭波
脂质体转染是分子生物学中研究基因功能和基因表达调控的常规手段。然而，在海水硬骨鱼细胞中，脂质体转染效率低下且很难通过转染后直接筛选的方式获得稳转细胞。本研究以pminiTol2为模板，在末端反向重复序列中间添加了CMV启动子、EGFP荧光蛋白、新霉素抗性基因等功能区域，构建了CMV-EGFP-pminiTol2重组载体。CMV-EGFP-pminiTol2和pCS-TP质粒经脂质体包裹共转染至牙鲆(Paralichthys olivaceus)卵巢颗粒细胞后，仅需2～3周的新霉素(G418)筛选即可获得稳定转染的细胞。本实验首次探究了利用Tol2转座子系统快速筛选获得牙鲆稳转细胞的方法，其研究成果可应用于牙鲆分子生物学研究，并为其他硬骨鱼类稳转细胞构建及筛选提供新的思路。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
龙炎杏 张学文 罗莎 肖楠 赵燕
为建立稳定的黄花蒿悬浮细胞系,以黄花蒿428–A植株的子叶、茎、腋芽和叶片为外植体,以MS为基础培养基,采用3因素(6–BA、NAA、2,4–D)4水平的L16(43)正交试验,优化黄花蒿愈伤组织诱导培养基,分析不同质量浓度(0、5、10、15、20、25、30 mg/L)潮霉素对黄花蒿悬浮细胞生长的影响,比较羧苄青霉素(0、100、150、200、250、300 mg/L)对农杆菌的抑制效果,并运用农杆菌介导法对黄花蒿悬浮细胞进行GUS报告基因及色氨酸单加氧酶iaaM基因的遗传转化。结果表明:黄花蒿叶片愈伤诱导率较高,叶片愈伤组织较优培养基为MS+6–BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L,出愈率可达99.33%;潮霉素最适筛选质量浓度为30 mg/L,羧苄青霉素最适抑菌质量浓度为200 mg/L;转基因抗性愈伤GUS组织化学染色及PCR鉴定结果表明,外源基因iaaM已导入并整合至黄花蒿基因组中。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘云 姜国良 张士璀 姜明 连建华
对牙鲆 (Paralichthysolivaceus )头肾印迹片、光镜片和电镜片的观察发现 ,其头肾主要集中于肾脏前部 2个分叉部分。组织学研究证明 ,头肾是由基质组织网络着不同发育阶段的血细胞构成 ,具无肾小球等分泌结构。进一步超微观察表明 ,基质是由网状细胞和成纤维细胞等组成 ,各种免疫细胞由淋巴细胞、单核细胞、颗粒细胞 (Ⅰ型和Ⅱ型 )以及巨噬细胞等组成。头肾中免疫细胞丰富 ,其中淋巴细胞占 36 .6 % ,单核细胞占 31.0 % ,颗粒细胞占 19.7%。说明牙鲆的头肾免疫细胞种类比较丰富 ,是免疫细胞的主要生发中心 ,在鱼体免疫防御系统中占有相当重要的地位。同时对特殊颗粒细胞的...
关键词：
牙鲆 头肾 免疫细胞
[期刊] 淡水渔业
[作者]
曾令兵 杨先乐 左文功 胡春生 陈艳红
使用一种廉价的培养基 CAS 替代昂贵的 Eagle′S MEM 培养草鱼 CIK 细胞系,细胞生长迅速而稳定,在1.5—2天内可长成汇合单层。CAS 的最佳培养浓度为0.1%。
关键词：
CIK 细胞系 廉价培养基 生长特性
[期刊] 中国水产科学
[作者]
汪沐 绳秀珍 战文斌
利用非变性电泳与病毒铺膜印迹技术(VOPBA)分离了牙鲆(Paralichthys olivaceus)鳃细胞(FG)上淋巴囊肿病毒结合蛋白,结果显示在FG细胞膜上有分子量为135 kD的蛋白与淋巴囊肿病毒特异结合;对该蛋白切胶回收后进行SDS-PAGE与双向电泳,发现135 kD蛋白由3个蛋白组成,分子量分别为58.3 kD、44.6 kD及37.6 kD;135 kD蛋白SDS-PAGE的VOPBA显示,仅出现37.6 kD的蛋白带,而58.3 kD、44.6 kD蛋白皆不与淋巴囊肿病毒结合。结果表明牙鲆FG细胞上135 kD蛋白是淋巴囊肿病毒的结合蛋白,其37.6 kD蛋白具有病毒结合活...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
武宁宁 刘翠 汪惟超 张俊玲
为明确牙鲆(Paralichthys olivaceus)foxl3的结构和功能,通过PCR克隆和测序获得了牙鲆foxl3的编码区(coding sequence, CDS)和3'非编码区(untranslated region, UTR),共1089 bp,其中开放阅读框(open reanding frame,ORF) 750 bp,编码249个氨基酸。Foxl3二级结构包含一个FH (Forkhead)结构域;三级结构则包含20.48%的α螺旋、15.26%的延伸链和64.26%的无规则卷曲,不均匀分布在蛋白多肽链上。比较多种生物Foxl3氨基酸序列发现,牙鲆Foxl3与其他鱼类相似度较高,其中与大菱鲆(Scophthalmus maximus)同源性最高,达到91.97%,与斑马鱼(Danio rerio)的同源性最低,仅为66.27%。通过氨基酸序列比对发现,与Foxl2相比, Foxl3在不同物种之间的差异更为显著,说明foxl3的进化速度比foxl2快。亚细胞定位显示,Foxl3细胞融合蛋白在细胞核和细胞质中表达。实时荧光定量PCR检测结果显示foxl3在牙鲆卵巢中表达量最高,显著高于精巢等其他组织,暗示foxl3可能在牙鲆卵巢发育与分化中具有重要意义。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
施志仪 陈晓武 顾一峰
牙鲆(Paralichthys olivaceus)体质量约0.5 kg,活体取材,通过免疫组织化学染色和H.E染色,在光学显微镜下观察牙鲆消化道组织结构。结果表明,牙鲆消化道和高等脊椎动物类似,分为口咽腔、食道、胃、胃盲囊和肠。肠也可分为前肠、中肠和后肠,三者之间没有明显的界限。胃和前肠是消化吸收主要的部位,胃盲囊和前肠结构和功能非常类似。Serotonnin细胞和P Substance细胞在牙鲆胃前部的黏膜中零星分布,在胃体中较多见,平均每104μm2胃体黏膜上皮约各有2.2和2.0个阳性细胞。而Gastrin细胞分布在胃盲囊和前肠中,平均每104μm2黏膜上皮分别有0.98个和0.71个...
关键词：
牙鲆 消化道 内分泌细胞 免疫组织化学
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
潘求真 田亮 徐曙光 韩红兵 李佳 李海 孙书锋 连正兴 杨宁 李宁 谭景和
用山羊组织块和0.25%的胰蛋白酶消化培养法获得正常传代细胞,对于出现的上皮样细胞和成纤维样细胞混合生长的问题,则根据两者贴壁紧实程度不同,用0.05%的胰酶-EDTA进行不同时间的消化,将其分离纯化。纯化的成纤维体细胞经数次传代培养后,进行冷冻解冻检验表明仍具有正常的传代能力。各代体细胞的核型分析表明,在体外培养至20~30代成纤维细胞的细胞形态(为梭形细胞,高度汇合后呈火焰状)、细胞周期以及核型均为正常,符合体细胞克隆转基因的基本要求。
关键词：
山羊 成纤维细胞 体外培养
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张春燕 周明国 王建新 张安莉 章文华
利用组织培养技术建立了水稻悬浮细胞和愈伤组织培养体系。用木聚糖酶激发子处理水稻悬浮细胞,引起细胞内过氧化氢和超氧阴离子含量迅速升高。木聚糖酶和稻瘟病菌提取物处理水稻悬浮细胞1 h后,编码几丁质酶的基因Cht-1表达明显增加,而编码病程相关蛋白的PR10基因没有表达,但处理12 h,后者表达明显增加。用稻瘟病菌提取物和激发子木聚糖酶处理水稻悬浮细胞,均诱导水稻细胞合成樱花素——专抗稻瘟病的抗毒素。若用它们处理水稻愈伤组织,则引起组织褐化、生长量降低、密度下降。初步结果表明:水稻悬浮细胞和愈伤组织是研究水稻抗稻瘟病机制方便、合适的实验材料。
[期刊] 水产学报
[作者]
陈晓武 施志仪 江山 李倩
采用RACE和荧光定量PCR技术克隆牙鲆生长抑素(SS)基因cDNA序列并且分析了其在仔鱼期的表达规律,同时通过免疫细胞化学染色,对牙鲆胃肠道和脑垂体等器官的生长抑素分泌细胞进行定位。最终获取包含完整编码区的牙鲆SS基因cDNA序列,其编码区长为381 bp,推测编码的蛋白质为126个氨基酸,其前23个氨基酸为信号肽,分子量为14.3 ku,理论等电点为8.33。牙鲆仔鱼不同发育时期的SS基因表达量比较结果表明,出膜后仔鱼体内SS基因表达不断增加,到变态发育期变化不大,变态后期又开始显著增加。免疫组织化学染色结果表明,SS细胞存在于胃、胰腺和脑垂体中。在胃中,生长抑素分泌细胞主要分布于胃上皮层...
关键词：
牙鲆 生长抑素 序列分析 免疫组化
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