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[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王宣刚 孔祥福 王欣桐 李恒顺 刘金相 王志刚 于海洋
牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国重要的海水增养殖鱼类，先天性免疫在其抵抗外界病原体入侵中发挥重要作用。巨噬细胞作为先天性免疫过程的重要组成部分，在鱼类免疫应答中扮演重要角色。巨噬细胞一般无法传代培养，因此，建立高效的巨噬细胞分离及原代培养技术显得尤为重要。本研究使用密度梯度离心法从牙鲆头肾中分离得到了巨噬细胞，通过差速贴壁法对获得的细胞进行纯化，后续经过优化培养条件和培养过程，采用L-15培养基(Gibco)、5%胎牛血清、1%青–链霉素、1%非必需氨基酸、30% L929细胞培养基在24℃、无CO_(2)的条件下进行培养，显微镜观察及吉姆萨染色结果显示，贴壁细胞具备巨噬细胞形态特征，使用巨噬细胞特异性基因标记mpeg1基因对细胞进行鉴定，结果显示，在分离得到的细胞中成功扩增出该基因。本研究建立了牙鲆巨噬细胞分离和培养技术，为体外研究巨噬细胞功能、深入了解硬骨鱼先天性免疫奠定了基础。
关键词：
牙鲆 巨噬细胞 原代培养 鉴定
[期刊] 水产学报
[作者]
陶会竹 肖宁 赵雨婷 房慧 李槿年
为了建立草鱼肠巨噬细胞的分离培养与鉴定方法,本研究在采用刮除法结合胶原酶IV消化法制备肠黏膜固有层单细胞悬液的基础上,使用鱼类脏器单核细胞分离试剂盒分离肠巨噬细胞,再经差异贴壁法纯化肠巨噬细胞,最后,用含10%胎牛血清和5%草鱼血清的RPMI 1640完全培养液,在28°C、5%CO2条件下原代培养肠巨噬细胞,并通过细胞形态学检查、分子标记检测和功能验证实验加以鉴定。结果显示,每尾鱼(约250 g)肠巨噬细胞的获得量约为3×107个,细胞活率为99.6%,纯度达到95%以上;倒置显微镜观察发现,原代培养4~5 d的贴壁细胞多呈圆形或多边形,体积明显增大,细胞汇合度达到95%;光镜和电镜观察到染色后的贴壁细胞具有巨噬细胞的形态结构特征,贴壁细胞经荧光定量PCR在m RNA水平检测到巨噬细胞特异性标志分子(草鱼巨噬细胞集落刺激因子受体),功能实验证实贴壁细胞具有吞噬功能,脂多糖能够显著提高其呼吸暴发活性。本研究首次成功建立了草鱼肠巨噬细胞的分离培养与鉴定方法,为开展口服疫苗诱导的草鱼肠黏膜免疫应答研究提供细胞模型。
关键词：
草鱼 肠巨噬细胞 分离 原代培养 鉴定
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘云 姜国良 张士璀 姜明 连建华
对牙鲆 (Paralichthysolivaceus )头肾印迹片、光镜片和电镜片的观察发现 ,其头肾主要集中于肾脏前部 2个分叉部分。组织学研究证明 ,头肾是由基质组织网络着不同发育阶段的血细胞构成 ,具无肾小球等分泌结构。进一步超微观察表明 ,基质是由网状细胞和成纤维细胞等组成 ,各种免疫细胞由淋巴细胞、单核细胞、颗粒细胞 (Ⅰ型和Ⅱ型 )以及巨噬细胞等组成。头肾中免疫细胞丰富 ,其中淋巴细胞占 36 .6 % ,单核细胞占 31.0 % ,颗粒细胞占 19.7%。说明牙鲆的头肾免疫细胞种类比较丰富 ,是免疫细胞的主要生发中心 ,在鱼体免疫防御系统中占有相当重要的地位。同时对特殊颗粒细胞的...
关键词：
牙鲆 头肾 免疫细胞
[期刊] 华北农学报
[作者]
王秋华 陈明 黄维义 王瑞 李莉萍 甘西 雷爱莹 黄均 梁万文
为获得罗非鱼腹腔巨噬细胞体外分离培养条件和培养形态特征,试验在不同饲养温度和时间点注射角鲨烯的奥尼罗非鱼进行腹腔巨噬细胞分离;通过培养基血清筛选和瑞氏染色对分离的巨噬细胞进行了体外培养及其形态观察。结果表明,19～25℃饲养温度有利于腹腔巨噬细胞分离,大于28℃对分离效果有明显影响;注射角鲨烯后48～72 h是分离腹腔巨噬细胞最佳时期;体外培养显示自体血清有利于罗非鱼腹腔巨噬细胞的存活与生长,胎牛血清不适于罗非鱼腹腔巨噬细胞培养。同时,罗非鱼腹腔巨噬细胞体外培养具有哺乳动物巨噬细胞相似特征,形态不规则、核浆比值低、贴壁生长、可形成多核巨大细胞。为下一步研究罗非鱼腹腔巨噬细胞免疫学功能奠定了基础...
关键词：
罗非鱼 腹腔巨噬细胞 分离 培养
[期刊] 水产学报
[作者]
樊廷俊 史振平
利用PEG介导的细胞融合方法 ,将已成系的牙鲆鳃细胞与中国对虾淋巴细胞进行细胞杂交 ,对所获得的杂交细胞用MEM∶MPS( 1∶1)混合培养液进行体外培养。培养 5天后发现 ,杂交细胞长成了单层 ,传代培养后仍可继续生长和分裂。通过逐渐提高混合培养液中MPS的所占比例所筛选出的杂交细胞 ,目前已传 12代 ,生长和分裂势头仍然十分旺盛。通过接种对虾杆状病毒发现 ,10天后杂交细胞出现了明显的病变特征 (细胞收缩变圆、脱落、死亡 ) ,至 14天细胞便几乎完全脱壁死亡。取病变细胞的培养上清 0 .3mL再加入到一瓶已长成单层的杂交细胞中 ,结果 5天后杂交细胞也出现了明显的病变特征 ,而未接种病...
关键词：
牙鲆 中国对虾 杂交细胞 体外培养
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
程安怡 赵金鹏 黄小红 张伟妮
为了探究脂多糖(LPS)对大黄鱼原代头肾巨噬细胞(PKM)的激活作用及其相应受体,采用流式细胞术检测LPS对大黄鱼PKM吞噬活性和氮呼吸爆发的影响,用实时荧光定量PCR检测LPS对3种促炎因子(IL-1β、IL-6、IL-8)和7种受体基因(TLR1、TLR2、TLR21、MR1、MR2、NOD1、NOD2)转录水平的影响.结果显示:0.1μg·mL~(-1) LPS可以显著提高大黄鱼PKM的吞噬能力(P<0.01);LPS可以显著上调3种促炎因子(IL-1β、IL-6、IL-8)和6种受体基因(TLR1、TLR2、TLR21、MR2、NOD1、NOD2)的表达水平,显著下调MR1的表达水平.研究表明,LPS对大黄鱼PKM有明显的激活作用,并刺激细胞向M1型巨噬细胞分化.
[期刊] 水产学报
[作者]
李庆飞 崔坤 艾庆辉 麦康森
为研究温度对离体大黄鱼头肾巨噬细胞抗氧化能力和炎性反应的影响,从大黄鱼头肾组织中分离巨噬细胞结合贴壁筛选法得到细胞单层后,在不同温度(16、22和28°C)下培养备用。使用25μg/mL的脂多糖(LPS)孵育细胞2 h后,测定不同培养温度下离体细胞活力、呼吸爆发活性、抗氧化酶(SOD和CAT)活性以及相关基因(SOD、CAT、Hsp70和IL-1β)表达的情况。结果显示,体外培养细胞36 h后,16°C和22°C条件下培养的细胞活力显著高于28°C处理组;LPS处理组大黄鱼头肾巨噬细胞呼吸爆发活性显著升高,但SOD和CAT酶活性较对照组显著下降。高温(28°C)显著提高了细胞CAT酶的活性和基因表达水平,但SOD酶活性和基因表达变化差异不显著;LPS显著促进了大黄鱼头肾巨噬细胞IL-1β基因的表达,并且随培养温度升高细胞IL-1β基因的表达水平显著降低;但大黄鱼头肾巨噬细胞Nrf2和Hsp70的基因表达量随温度升高而显著增加,且LPS处理组细胞基因表达水平显著高于对照组。研究表明,温度显著影响了离体大黄鱼头肾巨噬细胞的抗氧化能力和LPS所诱导的促炎基因的表达,Nrf2和Hsp70在这一过程中可能发挥重要作用。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
任国诚 陈松林 沙珍霞
漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)是中国近年新开发的重要海水养殖鱼类,本研究以漠斑牙鲆囊胚期胚胎为材料,探索了鱼类胚胎细胞分离和培养的条件,建立了漠斑牙鲆胚胎细胞培养技术。建立的漠斑牙鲆胚胎细胞系(SFEC)至今已经培养了240多天,传至80多代。SFEC的完全培养基采用添加抗生素、胎牛血清(FBS)、花鲈血清(SPS)、成纤维生长因子(bFGF)的DMEM。SFEC形态小而呈圆形、多边形,在培养基中生长迅速。本实验检测了温度、胎牛血清浓度、成纤维生长因子对SFEC生长的影响。在24~30℃之间SFEC生长良好,但当温度低于18℃时细胞生长速度明显减慢。在含15%FB...
[期刊] 水产学报
[作者]
殷国俊 Geert Wiegertjes LI Yue-ming Johan Schrama Johan Verreth 徐跑 周洪琪
用密度梯度离心分离鲤头肾中的巨噬细胞和嗜中性粒细胞。用RPMI细胞培养液对分离的细胞进行原代培养,在细胞培养液中加入不同浓度的黄芪水提取液来研究黄芪对鲤头肾中免疫细胞非特异性免疫应答的影响。黄芪水提取液单独使用时能刺激鲤头肾中巨噬细胞的增殖,但不能刺激巨噬细胞的氮暴发活性。用黄芪和脂多糖(LPS)混合刺激巨噬细胞和中性粒细胞时,黄芪水提取液能显著提高脂多糖刺激所产生的一氧化氮的产量。研究结果表明,黄芪不仅能刺激巨噬细胞数量的增加,而且能协同脂多糖增强头肾中免疫细胞的功能,从而对机体的非特异性免疫起调节作用。
关键词：
鲤 黄芪 巨噬细胞 免疫应答
[期刊] 中国农业科学
[作者]
萨仁娜 佟建明 何春年 高微微 张琪
【目的】通过研究海带岩藻聚糖及其级分对肉鸡巨噬细胞免疫功能的影响,寻找海带提取物调节肉鸡免疫功能的有效级分,为饲料工业科学使用海带资源提供理论依据。【方法】采用水提醇沉的方法,从海带中提取岩藻聚糖,通过纤维柱和凝胶柱层析,对岩藻聚糖进行分级纯化。体外培养肉鸡腹腔巨噬细胞,在培养液中分别加入岩藻聚糖(200μg·ml-1)和岩藻聚糖5种级分(100μg·ml-1),采用MTT方法检测细胞存活率,采用ELISA检测细胞因子IL-1和TNF-α,同时测定巨噬细胞的吞噬活性等其它免疫指标。【结果】海带岩藻聚糖及其级分显著提高肉鸡腹腔巨噬细胞的吞噬活性,促进巨噬细胞呼吸爆发、NO的产生量和iNOS活性,...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
向华 张彦明 程媛媛 康恺 杨幼聪
【目的】建立新生山羊肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cell,RTECs)的分离培养方法。【方法】采集刚出生未哺乳健康山羊的肾脏,分别采用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ消化法分离培养RTECs,选择孔径0.15mm的筛网对RTECs进行纯化,观察各组RTECs的生长情况;对分离的RTECs进行免疫组化和碱性磷酸酶染色鉴定,并进行透射电镜观察;用流式细胞仪检测RTECs的增殖周期和凋亡情况。【结果】胶原酶Ⅳ对RTECs的消化效果优于胶原酶Ⅰ,所得的细胞团块多,纯度高,细胞生长快,经孔径0.15mm的筛网过滤后,RTECs的纯度达95%以上,并可连续传至第12代。分离获得的细...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
姚静 钱存忠 张皎 张建峰 侯加法
从18日龄鸡胚长骨(股骨和胫骨)中机械分离破骨细胞于盖玻片和骨片上培养,以建立鸡胚破骨细胞体外培养方法。结合倒置相差显微镜、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、甲苯胺蓝染色及透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)对其形态和功能进行观察鉴定。结果表明,直接分离的细胞具有典型的破骨细胞的形态特点:属多核大细胞,TRAP染色阳性,能在骨片表面形成吸收陷窝。结论:鸡胚长骨机械分离法可获得一定数量并具有骨吸收活性的破骨细胞。
关键词：
鸡胚 破骨细胞 培养 鉴定
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
韩雅婷 杨学义 徐小明 史明艳 窦忠英
采用酶消化法和组织块法对小鼠、奶山羊、奶牛和家猪的表皮干细胞进行了分离、培养。结果表明:酶消化法适于小鼠表皮干细胞的分离,所获得的小鼠表皮干细胞在维持了两代之后自发分化为神经样细胞;奶山羊和奶牛不论用酶消化法还是组织块法都可以获得大量活力相对较好、表皮干细胞特性维持较久的细胞,奶山羊表皮细胞采用型胶原分选,用有血清培养液培养,经免疫细胞化学鉴定为表皮干细胞,可持续传至少9代,随着代数增高,细胞活力减弱。
关键词：
表皮干细胞 分离 培养 鉴定
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
姜茂成 詹康 严康 赵倩明 赵国琦
在体外分离培养奶牛瘤胃上皮细胞,可为奶牛瘤胃生理功能和吸收机制研究和永生化奶牛瘤胃上皮细胞奠定基础。通过胰蛋白酶消化法从奶牛瘤胃组织中分离出瘤胃上皮细胞,并通过免疫细胞化学的方法检测细胞角蛋白,CCK-8检测细胞生长曲线,β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞的衰老以及细胞染色体核型分析来鉴定瘤胃上皮细胞。结果表明:1)利用胰蛋白酶消化法可以稳定的培养出瘤胃上皮细胞并且能够在体外传代大约5代;2)通过在显微镜下进行细胞形态的观察呈单层"岛屿状";3)在荧光显微镜下细胞角蛋白抗原能够发出绿色荧光;4)奶牛瘤胃上皮细胞传
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