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[期刊] 水产学报
[作者]
龚小玲 鲍宝龙 杨桂梅 任大明
在前期的研究中,克隆到牙鲆变态早期和变态前差异表达的parvalbumin基因片断cDNA。为了克隆parvalbumin基因的全长cDNA,构建了变态早期(孵化后23d仔鱼)牙鲆头部的全长cDNA文库,并对文库的滴度和插入片段大小进行了评估。同时采用锚定PCR法从cDNA文库筛选出parvalbumin基因的全长cDNA。结果表明,所构建的牙鲆变态早期头部cDNA文库的滴度为1.2×106PFU·mL-1,插入片段的平均长度为1000bp左右。parvalbumin基因的全长cDNA的长度为603bp,编码109个氨基酸,含有两个EF手型钙离子结合域:DQDGSGFIEEEEL(52～64)...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
韦芬 何欣慰 鲍宝龙
Ras主要参与表皮生长因子家族调控细胞分裂的信号通路。采用末端快速扩增法获得了牙鲆(Paralichthys olivaceus)ras-2基因全长2 384 bp cDNA序列,该序列编码187个氨基酸,含有switchⅠ、switchⅡ、P-loop、CAAX box等Ras家族的结构特征,与川鲽(Platichthys flesus)ras-2氨基酸序列相似性最高(96.3%)。定量RT-PCR检测显示ras-2基因在牙鲆成体的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、鳃、肠、肌肉、鳍条和皮肤组织均有不同程度的表达,其中鳍条表达量最高,肌肉的表达量最低;在牙鲆变态前和变态初相对表达量较高,随着变态进行,表...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
谢彩霞 邢巨斌 鲍宝龙
为了调查表皮细胞分裂原epigen基因是否与牙鲆变态发育有关,分析了从变态期牙鲆仔鱼cDNA文库中测序得到的epigen基因。发现epigen基因编码162个氨基酸,具有信号肽序列,一个跨膜结构域和EGF-like结构域。EGF-like结构域包含有可形成3个二硫键的6个半胱氨酸残基,是表皮生长因子家族的结构特征。此外,利用荧光实时定量RT-PCR,调查了epigen基因在牙鲆眼睛移动过程中的变化。相比眼睛移动之前(17DAH,day after hatching),epigen基因在眼睛移动初期(19DAH)表达明显增强,为17DAH时的2.363倍;而在眼睛移动过程的高峰期(23DAH),...
[期刊] 水产学报
[作者]
鲍宝龙 杨桂梅 施志仪 任大明
为了克隆变态早期牙鲆头部差异表达的基因,采用抑制差减杂交法,以变态前的仔鱼头部表达的RNA作为驱动RNA,建立了牙鲆变态早期的差减cDNA文库,并利用相对定量RT-PCR对其进行了筛选。差减库的平均插入片段558bp左右,阳性率为81.8%。随机测定的45个克隆,在剔除假阳性克隆后,共得到22个不同的基因,其中13个为已知cDNA的同源基因,而另外9个为已知蛋白的同源基因,分别为prolactin receptor-like,COL1A1,M-3muscarinic receptor,Sfrs3,tropomyosin,ribosomal protein L27,ribosomal prote...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
高丽娜 付元帅 施志仪 苏艳芳 张红梅
通过ＰＣＲ技术，从牙鲆（ＰａＲａｌｉＣｈｔｙｓ ｏｌｖａＣｅｕｓ）总ＲＮａ中获得牙鲆ｌｉＮ－２９基因Ｃ ＤＮａ序列，该序列全长１ ７６９ ｂＰ，包括１ ３２９ ｂＰ开放阅读框，编码４４２个氨基酸，预测其是一种多锌指结构蛋白；氨基酸序列对比分析显示，牙鲆ｌｉＮ－２９与大黄鱼（ｌａＲｉｍｉＣｈｔｈｙｓ ＣＲｏＣｅａ）的同源性最高，达９５．２５％；系统进化树分析表明，牙鲆与其他鱼类聚集一支，并且与罗非鱼的进化关系最近。荧光定量ＰＣＲ显示，在牙鲆胚胎和仔鱼发育阶段，以原肠胚期ｌｉＮ－２９表达量最高；组织表达分析表明，脑中表达最高，肌肉中最低。外源甲状腺激素（ｔｈ）在牙鲆仔鱼发育初期（ｔｈ处理后２ Ｄ、．．．
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
邢巨斌 谢彩霞 张逸飞 鲍宝龙
牙鲆(Paralichthys olivaceus)不仅是研究鱼类变态的模式生物,也是我国的重要水产养殖对象。从变态前牙鲆cDNA文库中的42个单一序列表达标签(ESTs)中筛选到46个微卫星分子标记,从中选择21个微卫星并在一个养殖牙鲆群体共30个样本中测试,结果表明其中有20个微卫星标记具有多态性,其等位基因数为2到6个,观察杂合度从0.06到1.00,期望杂合度从0.059 7到0.825 2变化不等,平均多态信息含量是0.457 5,可用于牙鲆连锁图的构建和分子标记辅助选育。其中,有3个微卫星位点的三核苷酸重复序列在基因编码区内,可能和基因功能有关。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
杨长庚 刘姗姗 孙冰 陈松林
为了研究牙鲆(Paralichthys olivaceus)免疫及抗病相关蛋白和大分子物质的功能及相互作用机制,构建了牙鲆酵母双杂交cDNA文库。原始文库滴度为1.6×106 CFU/mL,随机选取单克隆菌落进行PCR扩增,根据PCR扩增结果表明插入片段大部分大于500 bp,平均长度约为1.5 kb,随机调取了115个EST进行了序列测定。扩增后放大文库库容约为1.8×1012 CFU。转化酵母后,文库转化效率为3.6×105CFU/μg,文库库容为5.4×106CFU。牙鲆酵母双杂交文库的构建成功为鲆蝶类免疫机理的研究,尤其是信号分子通路研究提供有效的工具。
关键词：
牙鲆:酵母双杂交 免疫相关基因 信号通路
[期刊] 海洋渔业
[作者]
苏艳芳 付元帅 施志仪 张红梅 高丽娜
采用RACE-PCR技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)组织中克隆了血清应答因子(SRF)基因全长序列,该序列全长2 477 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸。通过氨基酸同源序列比对,牙鲆SRF与其它物种的同源性较高,在氨基酸序列的N端具有NLS结构域和高度保守的MADS结构域。用PCR方法扩增SRF基因的编码区片段,克隆到p EGFP-N1载体中,构建真核表达载体p EGFP-N1-SRF,将重组质粒转染牙鲆胚胎细胞,在荧光显微镜下观察转染细胞有绿色荧光蛋白表达。荧光定量PCR和Western blot实验进一步证实,SRF在转染细胞中高表达。说明...
关键词：
SRF 牙鲆 克隆 真核表达
[期刊] 水产学报
[作者]
徐建勇 陈松林
采用同源克隆及基因组步移的方法,分离克隆了牙鲆肌肉生长抑制素(MSTN)基因。经过序列分析及cDNA验证,牙鲆MSTN基因具有3个外显子和2个内含子,编码377个氨基酸。5′侧翼区含有8个TATA框,一个CAAT框,6个E框;3′侧翼区含有加尾信号。通过同源分析,牙鲆MSTNC末端含有9个保守半胱氨酸残基和一个RVRR蛋白酶酶切位点;通过进化树分析,牙鲆MSTN与鱼类MSTN基因聚为一支。RT-PCR分析表明,牙鲆MSTN在胚胎发育中不表达或表达量较低,说明MSTN在牙鲆胚胎发育中并不起重要作用;其在各组织中的表达,随个体和环境的不同而有差异,暗示MSTN的表达受外界因素调控。
关键词：
牙鲆 肌肉生长抑制素 克隆
[期刊] 海洋渔业
[作者]
孙近近 张俊玲 孙文慧 施志仪
ｄａｚｌ（ｄｅｌｅｔｅｄ ｉｎ ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ－ｌｉｋｅ）基因是多种物种精子发生的重要调控因子，为探讨该基因在牙鲆（ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）性腺发育分化中的作用，本研究采用同源克隆和ｒａｃｅ技术克隆了牙鲆ｄａｚｌ基因的ｃｄｎａ序列，利用生物信息学方法分析了其序列结构，并利用实时荧光定量ｐｃｒ技术检测了该基因在牙鲆成体组织和早期发育阶段的表达情况。结果发现：牙鲆ｄａｚｌ ｃｄｎａ序列全长２ ０３１ ｂｐ，包括１０５ ｂｐ的５＇端非翻译区，１ ２７５ ｂｐ的３＇端非翻译区和编码２１７个氨基酸残基的６５１ ｂｐ开放阅读框；氨基酸同源序列比对显示该序列存在一个高度保守的ｒ．．．
关键词：
牙鲆 dazl cDNA克隆 基因表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨莹 王沥浩 邹德毅 王清曼 强卫东 许心怡 陈伟 王凯 杨晶
【目的】构建红花种子cDNA文库,挖掘红花脂肪酸代谢途径相关基因,为红花品质改良的基因工程研究奠定基础。【方法】以红花成熟种子为材料,通过Trizol法,提取红花种子总RNA,使用GeneRacer?Kit和CloneMinerⅡcDNA Library Construction Kit试剂盒构建cDNA文库。并对cDNA文库的重组率和插入片段进行鉴定,从中获得contig和singlet片段及脂肪酸代谢相关基因,通过荧光定量PCR,测定delt-12脂肪酸脱氢酶基因在不同开花时期(14,16,18,20d)红花种子中的表达量。【结果】构建的红花种子cDNA文库总克隆数为7.5×106,重组率...
关键词：
红花种子 cDNA文库 克隆
[期刊] 中国水产科学
[作者]
施志仪 吴明林 付元帅
let-7是时序发育过程中的重要调控因子,在促进幼体向成体转变过程中起着极其重要的作用。为探讨let-7对牙鲆(Paralichthys olivaceus)从幼体到成体转变的变态发育过程的影响,本实验对let-7进行了克隆与表达研究,并预测了其可能的靶基因。利用普通PCR技术从牙鲆中成功鉴定出let-7及其前体序列,该前体序列在不同的物种间具有高度的保守性。运用实时荧光定量RT-PCR方法分析let-7在牙鲆变态发育不同阶段的表达,结果发现,水温(16±0.5)℃条件下,在牙鲆变态发育的前5个阶段(孵化后17、20、23、29、36 d),let-7的表达量逐渐上升,在变态末期(36 dph...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
姜宏波 王桂兴 刘海金 唐晓阳 包杰
以中国水产科学研究院北戴河中心实验站养殖的双单倍体(DH)牙鲆(Paralichthys olivaceus)作为亲鱼,采用冷休克方法抑制第二极体排出,建立牙鲆克隆家系。以普通牙鲆的一个家系作为对照组,在同样饲养条件下进行培育。实验组和对照组均为2+龄鱼,克隆家系随机抽取5尾,体质量(1 398±88)g;普通群体随机抽取10尾,体质量(1 749±125)g。分别采集血液进行血液生理和生化指标的比较分析。结果表明:1)克隆牙鲆的红细胞数量(RBC)、血红蛋白数量(HGB)、平均血红蛋白量(MCH)、红细胞压积(HCT)极显著低于普通牙鲆(P<0.01),而在其他血液生理指标上二者没有显著性差...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
马慧鑫 王磊 汪林庆 周茜 陈松林
本研究克隆得到牙鲆(Paralichthys olivaceus)精氨酸酶Ⅱ基因(ArginaseⅡ,Arg-Ⅱ)全长cDNA序列,并检测了Arg-Ⅱ在牙鲆免疫组织和细菌感染过程中的时空表达模式。结果显示,Arg-Ⅱ基因cDNA全长1882 bp,包含1050 bp开放阅读框,编码349个氨基酸(预测分子量为38.02 kDa,等电点为6.42)。Arg-Ⅱ基因编码的氨基酸序列具有典型的精氨酸酶结构特征,推测与哺乳动物中的功能类似。系统进化分析显示,鱼类Arg-Ⅱ基因合成一簇,其中,Arg-Ⅱ基因与鲈鱼(Lates calcarifer)相关度最高(93%)。实时荧光定量结果显示,Arg-Ⅱ基因在健康牙鲆的肝、脾和鳃等免疫组织中有较高表达。进一步研究发现,经迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染的牙鲆成鱼中,主要免疫组织中Arg-ⅡmRNA的表达量在细菌感染后6~12 h显著上调,随后表达量恢复正常。离体培养的牙鲆巨噬细胞经迟缓爱德华氏菌感染后,Arg-Ⅱ基因也呈显著上调模式。因此,本研究结果表明,Arg-Ⅱ基因参与牙鲆响应迟缓爱德华氏菌感染的免疫过程,揭示Arg-Ⅱ基因可能在牙鲆抗病免疫中发挥重要作用。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张永珍 陈松林 王磊
趋化因子是一类具有化学趋化功能的小分子分泌性蛋白,能够引导白细胞到损伤或者感染的部位,参与免疫调节和病理反应。为丰富鲆鲽鱼类趋化因子的相关基础研究,本研究克隆了牙鲆(Paralichthys olivaceus)趋化因子基因CXCL9,其全长为910 bp,开放阅读框为408 bp,编码135个氨基酸。该基因具有趋化因子超家族的典型特征,在35、37、60和77个氨基酸位置具有4个保守的半胱氨酸残基,形成两个二硫键。氨基酸序列分析表明,该基因与大菱鲆(Scophthalmus maximus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的CXCL9基因具有较高的同源性,分别为78.5%和71.0%。实时荧光定量PCR结果显示, CXCL9在正常牙鲆肝脏和脾脏中的表达量非常高,在皮肤和鳃等组织中表达量次之,说明CXCL9特异性地在免疫相关组织中表达。经迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA表达量在感染后6 h即出现高峰值,而头肾和脾脏中的高峰值出现较晚。经鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后6 h,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA的表达量升高近8倍,头肾中的表达高峰值出现在感染后24 h,而脾脏中CXCL9 mRNA的表达量在感染后6 h迅速升高10倍,逐渐降低后48 h又出现高峰,为正常水平的20倍。上述研究结果说明CXCL9基因在病原菌感染过程中有快速响应,可能参与了免疫防御过程,将有可能发展为一种牙鲆细菌性疾病的生物标记。本研究为牙鲆趋化因子超家族免疫机制的深入研究奠定了基础。
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