以版纳微型猪近交系妊娠47d的胎儿为材料,采用胰蛋白酶消化法消化培养胎儿成纤维细胞,对其进行细胞形态观察、细胞冻存前和复苏后存活率测定、生长曲线绘制和染色体核型分析等生物学特征检测.结果表明,培养的版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态;细胞冻存前和复苏后的存活率分别为98.06%和92.12%;生长曲线呈"S"形,倍增时间为36h;对所制备染色体核型进行分析,显示2n=38,XY,并在体外培养14个代次后仍能保持正常核型.

【目的】以滩羊胎儿皮肤组织为材料,获得符合体细胞克隆转基因基本要求的供体细胞系。【方法】取滩羊胎儿皮肤组织,采用组织块法分离培养获得滩羊胎儿成纤维细胞,观测其形态和生长情况,鉴定其性别,并对其染色体核型和红色荧光报告基因质粒(pmCherry-N1)转染等生物学特性进行研究。【结果】采用组织块法成功获得了滩羊胎儿成纤维细胞,其细胞群体倍增时间(PDT)约为48h;5代、15代、25代滩羊胎儿成纤维细胞核型分析表明,各代细胞染色体均为2n=54,未见异常;滩羊胎儿成纤维细胞的转染效率较高,约为50%,对最终获得的稳定表达红色荧光蛋白的胎儿成纤维细胞进行核型分析,结果证明遗传物质没有发生变化。【结...

为获得可用于体细胞核移植中需要的供核细胞,本试验研究了大白猪仔猪(约克夏)皮肤成纤维细胞分离、培养、传代的方法,及其体外生长特征。应用本研究方法,所培养细胞在体外的生长增殖过程呈典型的"S"型。在冷冻、复苏试验中,组织块或细胞经冷冻保存复苏后活率较冻存前有所下降,但大多数细胞仍能正常生长。通过本方法,可以获得能在体外正常传代培养的细胞系,为动物克隆研究提供了供核细胞来源。

为研究克隆黄淮白山羊耳部皮肤成纤维细胞(cGSF)的体外培养及其生物学特性。通过组织块接种培养法和胰蛋白酶消化法均可以获得原代cGSF,但在接种培养24 h后,组织块法收获的细胞贴壁率和细胞量要明显高于胰酶消化法。就生长特征而言,cGSF的生长曲线也呈现典型"S"型,到达指数增长期、平台期的时间分别为第3,6天,早于普通黄淮白山羊的皮肤成纤维细胞(GSF),后者分别为第4,8天。cGSF原代(P0)、第2代(P2)、第8代(P8)细胞的染色体数目异常率均高于相同代数的GSF。在相同转染条件下,cGSF在转染p EGFP-N1后,再经G418筛选亦可形成克隆点,扩增获得阳性细胞系。总之,源自克隆...

【目的】通过建立过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系研究MyoD1基因的异位表达研究其在成肌分化中的生物作用。【方法】采用RT-PCR从激活的骨骼肌卫星细胞中克隆MyoD1基因,并将其cDNA终止密码子TGA定向突变为GGA,定向克隆至带有增强型水母绿色荧光蛋白(ehanced green fluorescent protein,eGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1,经过酶切、测序鉴定后,采用LipofectiminTMLTX转染山羊胎儿成纤维细胞(goat embryonic fibroblast,GEF)以建立MyoD1异位表达...

[目的]本文旨在利用Cas9蛋白/sgRNA体系，提高猪胎儿成纤维细胞的基因组编辑效率，为促进CRISPR/Cas9技术在猪上的广泛应用奠定基础。[方法]针对猪ROSA26位点的启动子区（包含第一外显子区）设计两条sgRNAs，并将其构建在PX459-Cas9-puro质粒上，以获得PX459-Cas9-sgRNA质粒。将sgRNA靶序列连同PAM序列构建在RGS-CR质粒上，以获得RGS-sgRNA质粒。使用PX459-Cas9-sgRNA质粒与RGS-sgRNA质粒系统共转染，筛选切割效率较高的一条sgRNA，并使用该sgRNA对猪胎儿成纤维细胞进行后续打靶实验。分别使用PX459-Cas9-sgRNA质粒和Cas9蛋白/sgRNA两种方法对猪胎儿成纤维细胞的靶位点进行基因敲除，将转染后的细胞提取基因组DNA，桑格尔测序检测打靶效率。[结果]成功构建了打靶猪ROSA26靶序列的PX459-Cas9-sgRNA质粒，及含PAM序列的RGS-sgRNA，且质粒测序结果显示序列插入正确；RGS-sgRNA筛选结果表明，sgRNA2的打靶效率极显著高于sgRNA1 (P < 0.01)，且sgRNA2无脱靶效应，因此后续使用PX459-Cas9-sgRNA2和Cas9蛋白/sgRNA2在猪胎儿成纤维细胞中进行打靶，并比较两者的打靶效率。在猪胎儿成纤维中，PX459-Cas9-sgRNA2质粒的打靶效率为16.67%，Cas9蛋白/sgRNA2体系的打靶效率为33.33%；[结论]Cas9蛋白/sgRNA体系较PX459-Cas9-sgRNA质粒提高了打靶效率约1倍，这对提高后续猪体细胞的基因敲入效率、促进基因编辑在猪上的应用有重要意义。

【背景】随着生物技术发展,研究的生理机制和生物功能日益复杂,提高大载体的转染效率对多基因共表达系统、基因编辑技术、转基因育种等具有重要的意义。在转基因育种中,使用的转基因载体相对较大,而且转基因动物的制备效率也与供体细胞猪胎儿成纤维(porcine Fetal Fibroblasts,PFFs)细胞的转染效率有关。【目的】研究主要从转染参数、质粒用量和拓扑结构三方面,比较3种电转仪ECM~?830/NEPA21/Nucleofector~(TM)2b的大载体转染效率,以探索大载体转染PFFs的最佳条件。【方法】使用3种不同电转仪将长达26 kb的携带增强型绿荧光蛋白基因的pPXAT-EGFP质粒转染1×10~6个PFFs,48 h后使用流式细胞仪测定荧光细胞比例,从电转参数、质粒用量和拓扑结构三方面分别比较瞬时转染效率。【结果】首先比较电转仪不同参数的转染效率,结果显示当电转参数为脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,NEPA 21转染PFFs的效率最高,为13.24%±1.63%,而Nucleofector~(TM) 2b的最佳电转参数为U-023,其转染效率高达46.36%±3.95%。然后在最佳电转参数下分别比较6、8、10和12μg的26 kb超螺旋质粒的转染效率,ECM~?830和Nucleofector~(TM) 2b转染PFFs的最佳质粒用量为12μg,其转染效率分别为8.44%±0.90%(电转参数:脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3次)和14.63%±3.21%(电转参数:U-023),而NEPA 21使用10μg质粒转染PFFs时效率达到最高(6.09%±0.72%)。最后比较不同质粒拓扑结构的转染效率,结果显示线性化质粒的转染效率较低,仅为超螺旋质粒转染效率的34.96%—48.39%。【结论】因此Nucleofector~(TM) 2b转染PFFs的最佳条件为:U-023程序、12μg超螺旋质粒;NEPA 21为:脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次、10μg超螺旋质粒;ECM~?830则在脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3次条件下转染12μg超螺旋质粒可获得最佳转染效率。综合比较上述3种电转仪,26 kb大载体转染PFFs的最佳电转仪是Nucleofector~(TM) 2b。

【目的】获得敲除肌肉生长抑制素(MSTN)基因的猪胎儿成纤维细胞。【方法】打靶载体的构建:以Neo为正筛选基因、HSV-tk为负筛选基因。在Neo的两侧分别插入同源长臂和同源短臂。同源长臂5382bp,包含MSTN基因的部分5′端,全部的exon1,intron1和exon2及大部分intron2;同源短臂844bp,包含部分exon3及3′端的部分序列。取35d胎龄的大白猪,用胰酶消化法,分离胎儿成纤维细胞并对其进行培养和建系。采用脂质体法将打靶载体导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用250μg·ml-1G418筛选7d,再用200μg·ml-1G418+2μmol·L-1GANC维持筛选...

采用组织块移植法,对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的肾脏组织细胞进行原代培养,建立了罗非鱼肾脏细胞系,已稳定传代培养50代以上,命名为TiK。罗非鱼肾脏细胞系为纤维样细胞,其最佳培养基为DMEM,最适培养温度为28℃,最适血清浓度为15%。在最适培养条件下,罗非鱼肾脏细胞系的群体倍增时间为45.8 h。细胞经液氮冷冻保存6个月后进行复苏,经台盼蓝染色,约(89.84±3.48)%的细胞具有活性,复苏后细胞生长旺盛。染色体分析显示,第32代罗非鱼肾脏细胞系染色体数目分布在20～66之间,众数为48。使用本实验室分离鉴定的罗非鱼病毒感染罗非鱼肾脏细胞,可产生典型的细胞病变效应,表明罗非鱼肾脏细胞对该病毒敏感。该细胞系的建立为罗非鱼病毒病防控技术研究提供了重要的实验材料。

为探究茶多酚(Tea polyphenols,TP)对体外培养鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibrolast,MEF)凋亡的影响。在MEF细胞培养液中添加质量浓度为0、10、40、70、100和150μg/mL的TP,分别培养24、48、72和96h,使用MTT法(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,噻唑蓝,MTT法)检测细胞活力;细胞培养72h,以RT-PCR检测B-细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(B cell lymphoma leukemia-2,Bcl-2)、和Bcl相关的蛋白X(Bcl-as-sociated X protein,Bax)、...

【目的】证实小鼠胎儿成纤维细胞中钙调蛋白(calmodulin,CaM)基因参与热应激诱导型热休克蛋白70(Hsp70)的基因表达并明确其作用条件。【方法】取12.5 d孕鼠胚胎制备成纤维细胞(MEF),上述细胞随机分为对照组和热应激组:对照组在37℃条件下培养,热应激组包括Ⅰ组(39℃、0.5 h),Ⅱ组(39℃、1 h),Ⅲ组(39℃、1.5 h),Ⅳ组(41℃、0.5 h),Ⅴ组(41℃、1 h),Ⅵ组(41℃、1.5 h);每组3个重复。将选择的热应激组和对照组细胞分别加入不同浓度(25、50及100 mmol.L-1)钙调蛋白拮抗剂W7,运用RT-PCR检测Hsp70、CaM mRN...

【目的】为了优化外源多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA转入山羊胎儿成纤维细胞(goat embryonic fibroblast,GEF)的条件,本试验针对转染试剂脂质体2000和转染方法进行研究。【方法】采用胰酶消化法,从山羊胎儿腿部肌肉组织中分离并获得了纯化的GEF细胞。根据m MESSAGE m MACHINE?T7 Ultra Kit试剂盒说明书,体外转录步骤主要有:1前期的质粒准备:首先用质粒小提试剂盒对摇菌获得的各体外转录载体质粒进行提取,随后对各体外转录载体目的基因下游进行单酶切,获得线性化质粒,最后用DNA纯化试剂盒对线性化的质粒进行纯化...

用山羊组织块和0.25%的胰蛋白酶消化培养法获得正常传代细胞,对于出现的上皮样细胞和成纤维样细胞混合生长的问题,则根据两者贴壁紧实程度不同,用0.05%的胰酶-EDTA进行不同时间的消化,将其分离纯化。纯化的成纤维体细胞经数次传代培养后,进行冷冻解冻检验表明仍具有正常的传代能力。各代体细胞的核型分析表明,在体外培养至20~30代成纤维细胞的细胞形态(为梭形细胞,高度汇合后呈火焰状)、细胞周期以及核型均为正常,符合体细胞克隆转基因的基本要求。

【目的】转录因子Oct4、Nanog是调节干细胞多能性相关的转录因子,在干细胞的分化和胚胎发育中有重要作用。本研究旨在克隆水牛Oct4和Nanog基因、分析基因序列和蛋白结构、构建逆转录表达载体,并在水牛体细胞中表达,为进一步研究其在水牛早期胚胎发育中的作用,以及为建立水牛胚胎干细胞系和诱导多能干细胞系(iPSC)奠定基础。【方法】分别从水牛生殖嵴和体细胞中提取RNA和DNA,将RNA反转录成第1链cDNA,参照牛基因序列(Oct4:NM_174580,Nanog:NM_001025344)设计特异性引物,采用RT-PCR和PCR分别扩增Oct4和Nanog的编码区序列(the coding ...

采取猪囊尾蚴组织,经过体外培养已建立一株细胞系,命名为猪囊尾蚴 CC-97免疫细胞系.原代培养30d 形成单层细胞,以1:2分种率传代培养,相隔7d 传代一次,连传24次,历时8个月之久.细胞系由三肿类型细胞组成,以椭圆形细胞占优势,梨形、球形者数额略相等.放射自显影法测定细胞分裂、~3H-TdR 显示细胞生长指数,均证明细胞对数增殖期长达7d,细胞生长从12h 开始倍增分裂,第4,5天相继达到倍增分裂高峰,细胞增殖率达11倍,增效达6.32×10~6mL~(-1),细胞周期约32h,细胞系二倍体细胞为主,染色体