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[期刊] 华北农学报
[作者]
陈倩 卓维 罗静 杨尚谕 鲁黎明 李立芹
为了研究烟草Nt RAP2-7基因在非生物胁迫响应中的功能,采用同源克隆的方法,在烟草品种K326中克隆到1个ERF转录因子基因Nt RAP2-7。并利用生物信息学软件分析了该基因编码蛋白的理化性质、空间结构与系统进化关系。序列分析结果表明,该基因序列全长1 398 bp,共编码465个氨基酸残基,预测蛋白的分子量为51. 16 ku。该蛋白包含一个由3个β-折叠及1个α-螺旋组成的保守结构,并含有58个磷酸化位点。亚细胞定位预测表明,该蛋白主要定位于细胞核,并包含单分型的核定位信号序列。进化分析表明,Nt RAP2-7蛋白与林烟草RAP2-7蛋白序列同源性最高,为98%。运用q RT-PCR技术进行了该基因的表达模式分析,组织表达分析发现,Nt RAP2-7基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,但在根中的表达量最高。该基因的表达在低钾、高盐、干旱、ABA、H2O2处理下受到诱导和在低温处理下受到抑制,结果表明,烟草Nt RAP2-7基因参与了烟草的非生物胁迫应答反应。并利用双酶切法成功构建了p BI121-Nt RAP2-7过表达载体,为今后该基因在非生物胁迫下的功能研究奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
张雪薇 刘仑 鲁黎明 李立芹
2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C-type protein phosphatases,PP2C)是ABA信号转导途径中的关键组分,在植物生长发育、细胞周期调节及应对逆境胁迫的过程中发挥重要的作用。为探究PP2C基因在烟草适应非生物胁迫中的功能,从烟草栽培品种K326中克隆到了一个PP2C同源基因,该基因开放阅读框为1 617 bp,编码538个氨基酸残基。同源性分析结果显示,该基因所编码的蛋白与绒毛状烟草PP2C16的亲缘关系最近,故命名为NtPP2C16。生物信息学分析表明,NtPP2C16催化
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈倩 杨尚谕 卓维 李佳皓 彭双 王静 李立芹
为了研究烟草中蛋白激酶CIPK3在植物非生物胁迫应答中的功能,通过同源克隆的方法,在普通烟草品种K326中克隆到1个CIPK家族基因NtCIPK3。利用生物信息学软件对该基因编码蛋白的结构和功能进行了预测分析。该基因包含一个1 272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸残基。蛋白序列分析表明,该蛋白含有一个跨膜结构域,且平均疏水性系数小于0,属于亲水性膜蛋白。蛋白比对分析发现,NtCIPK3含有高度保守的N端激酶区、连接区以及C端调控区,与野生烟草CIPK3的同源性最高,达99%。亚细胞定位预测显示,该蛋白主要定位于细胞核,且具有双分型的核定位信号序列。运用qRT-PCR技术,对该基因的表达特性进行了分析,组织表达分析发现,该基因在烟草的根、茎、叶、花中均有表达,但在叶中表达水平明显高于其他组织,推测可能主要在叶中行使功能。NtCIPK3基因在不同程度上受低钾、高盐、干旱、ABA、H_2O_2、低温处理的诱导,推测NtCIPK3基因在烟草的非生物胁迫应答反应中发挥了重要作用。并成功构建pBI121-NtCIPK3过表达载体,为今后该基因在非生物胁迫下的功能研究奠定了基础。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
邓晶 刘峰 郭清泉 陈建荣 张学文
根据已克隆的苎麻CCoAOMT(咖啡酰辅酶-A-氧甲基转移酶)基因cDNA序列,以其编码纤维素合成酶底物结合和催化合成结构域的cDNA序列为目标,采用PCR扩增方法引入克隆的酶切位点,分别将其正、反方向克隆到植物RNA干扰表达质粒PFGC5941T-DNA上CHSA内含子两侧,构建了植物表达苎麻CCoAOMT基因的干扰重组Ti载体.将该载体转入根癌农杆菌LBA4404后,采用农杆菌介导法对木质素研究的模式烟草WS38进行了遗传转化,抗性筛选和分子检测表明,成功获得了转基因植株.转基因植株生长延缓,表明可能存在基因表达干扰现象.
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
常欣 庞磊 李叶云 魏艳丽 江昌俊
【目的】通过转基因烟草验证茶树CsCBF1基因抗寒性功能,为发掘、筛选茶树重要功能基因提供理论依据。【方法】利用根癌农杆菌介导法将构建的表达载体pBI121-CsCBF1导入烟草,通过PCR、RT-PCR和GUS活性染色鉴定外源CsCBF1基因是否导入并整合到烟草基因组上转录表达。然后将转pBI121-CsCBF1型、转pBI121型和野生型烟草分别置于25,4和0℃下处理48h后,检测其膜质通透性、丙二醛(MDA)含量和叶绿素荧光参数Fv/Fm,并将0℃处理3d的转pBI121-CsCBF1型和野生型烟草置于25℃下培养1周后观测恢复表型和统计死亡率。【结果】成功构建表达载体pBI121-C...
关键词：
茶树 烟草 CsCBF1基因 抗寒性
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张丽华 程智慧 李霞
为了验证PR1B分泌肽对谜底蛋白的分泌和增强功能,以GUS基因为靶基因,成功构建了PR1B 和GUS融合基因的植物表达载体,通过三亲融合法转入LBA4404农杆菌,并对烟草进行了转化,在216株卡那抗 性植株中共获得2株GUS染色阳性植株。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
乔艳艳 杨翠云 于翠 曹洁 马青 张丽莉
根据烟草环斑病毒外壳蛋白(TRSV-CP)基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法,获得烟草环斑病毒基因组中编码外壳蛋白部分基因片段,将其插入原核表达载体pET28a中,获得重组表达质粒pET-CP,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导蛋白大量表达。重组蛋白经过Ni+-NTA纯化后,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,TRSV-CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,产生的融合蛋白分子质量约为34 ku,并具有免疫学活性。以纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,多抗血清效价达1∶409 600,可以与重组蛋白发生抗原抗体反应。
[期刊] 林业科学
[作者]
陈英 戴咏梅 黄敏仁 诸葛强 王明庥
多基因转化是基因工程研究热点之一。本研究应用DNA重组技术,将两个抗病机制不同,抗菌谱较广的抗病基因(天麻抗真菌蛋白GAFP和兔防御素NP1基因)构建在一个植物表达载体pBin35SGAFP-NP1上,两者具有各自的CaMV35S启动子和Nos终止子。通过根癌农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草,PCR和PCR-Southern分析证明已将NP1和GAFP基因整合到烟草基因组中。离体抑菌实验表明转基因植株对真菌和细菌表现出一定的抗性。以上结果表明通过该表达载体进行遗传转化可获得含双价抗病基因植物,并能有效表达,提高转基因植物抗病能力。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
唐前君 张德咏 刘勇 李基光 谢丙炎 肖启明
烟粉虱内共生菌groEL基因编码一种与植物病毒传毒相关的GroEL蛋白.以B型烟粉虱为研究对象,利用1对特异引物,对B型烟粉虱体内的groEL基因进行PCR扩增,选取502 bp groEL基因片段构建dsRNA,并将其连接植物表达载体pBIN19,将重组质粒电激转化农杆菌菌株LBA4404.采用农杆菌浸染转化本氏烟草,PCR筛选表明,目的片段已整合至转基因植株的基因组DNA;RT-PCR结果表明,502 bp的groEL基因片段在转基因植株中被转录.
[期刊] 华北农学报
[作者]
欧阳乐军 黄真池 沙月娥 曾富华
根据GenBank中植物病原物诱导型启动子碱基序列设计引物,以烟草基因组DNA为模板,扩增PPP3启动子。用PPP3替换pCAMBIA1301中与gus基因相连的35S启动子,构建重组质粒pCOMBIA+PPP3+gus后导入农杆菌GV3101。通过农杆菌介导的瞬时表达技术将受PPPs控制的gus基因导入烟草。分别接种青枯菌和水杨酸24 h后,烟草叶片中检测到gus基因转录效率分别提高了27.94,17.69倍。表明PPP3启动子具有本底表达水平低、诱导表达活性强的特点。
关键词：
诱导型启动子 瞬时表达 定量PCR
[期刊] 林业科学研究
[作者]
车代弟 王海峰 王金刚 龚束芳 樊金萍
利用简并引物RT-PCR,克隆复叶槭FtsZ基因的cDNA序列,利用马铃薯X组病毒载体pgR107,构建RNA干扰重组病毒载体pVX-AnFtsZi,并转化农杆菌GV3101(含辅助质粒pJIC Sa-rep)侵染烟草。40 d后,检测烟草内源FtsZ基因的表达量。研究结果表明:从复叶槭中克隆到的569bpFtsZ基因cDNA片段,具有FtsZ蛋白的核心功能序列GGGTGSG。构建的hpRNA型RNA干扰载体抑制了FtsZ基因的表达。为培育槭树类彩叶新品种奠定分子理论基础。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王冬梅 王明 李翠萍 苏承刚 张兴国 姚永宏
植物抗寒属于复杂的数量性状。单一基因转化,植株抗寒性提高有限。本文利用拟南芥的AtCBF1~3和AtICE14个基因构建植物表达载体pVCT2276,通过农杆菌介导法转化烟草,获得35株抗性苗。经抗性筛选以及PCR鉴定,8株显示为阳性植株。将其中5株繁殖成株系,为后续的抗寒鉴定奠定基础。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
韩占品 任健 于玮玮 范夕玲 李慧
【目的】为进一步探究花椰菜ERF114基因功能,从花椰菜中克隆ERF114基因并构建植物表达载体。【方法】利用RTPCR技术从花椰菜中分离ERF114基因;通过生物信息学软件对ERF114蛋白特性进行预测和分析;采用Gateway技术构建ERF114基因的植物表达载体。【结果】克隆获得了花椰菜ERF114基因,其全长为681 bp,编码226个氨基酸,具有1个AP2结构域。生物信息学分析显示,该蛋白质为亲水性蛋白,有1个跨膜区域,二级结构以α-螺旋,β-折叠和无规则卷曲结构为主。进化树分析表明,花椰菜ERF114与油菜的亲缘关系最近。同时成功构建了植物表达载体。【结论】成功克隆了花椰菜ERF114基因,对其进行生物信息学分析,并构建其表达载体,为探究花椰菜ERF114基因功能及分子调控机制奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
欧阳乐军 梁卓玲 黄真池 沙月娥 曾富华
【目的】构建aiiA基因的原核表达载体，并进行诱导表达，检测aiiA蛋白的抗病性，为进一步通过转基因技术培育转aiiA基因植株奠定基础。【方法】 从pMD-TM-19-T Vector＋aiiA质粒中酶切获得aiiA基因，将其与pGEX-4T-1表达载体连接构建重组原核表达载体pGEX-4T-1＋aiiA，经双酶切及测序鉴定后，进行诱导表达，并对表达产物的功能进行鉴定。【结果】双酶切与PCR检测结果表明，重组原核表达载体pGEX-4T-1＋aiiA构建成功。表达条件优化结果表明，在25 ℃下用0.2 mmol/L IPTG诱导9 h，aiiA蛋白的表达量最高。aiiA重组蛋白抑菌试验结果表明，...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
欧阳乐军 梁卓玲 黄真池 沙月娥 曾富华
【目的】构建aiiA基因的原核表达载体,并进行诱导表达,检测aiiA蛋白的抗病性,为进一步通过转基因技术培育转aiiA基因植株奠定基础。【方法】从pMDTM19-T Vector+aiiA质粒中酶切获得aiiA基因,将其与pGEX-4T-1表达载体连接构建重组原核表达载体pGEX-4T-1+aiiA,经双酶切及测序鉴定后,进行诱导表达,并对表达产物的功能进行鉴定。【结果】双酶切与PCR检测结果表明,重组原核表达载体pGEX-4T-1+aiiA构建成功。表达条件优化结果表明,在25℃下用0.2mmol/L IPTG诱导9h,aiiA蛋白的表达量最高。aiiA重组蛋白抑菌试验结果表明,其能够降解细...
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