【目的】从高抗PVY烟草品种VAM中克隆抗病相关基因,分析该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在烟草抗PVY防御反应中的作用,为培育抗PVY烟草新品种奠定基础。【方法】利用SSH结合cDNA芯片筛选出来的病害诱导特异表达基因片段,通过RACE技术克隆烟草抗病相关基因;生物信息学分析该基因保守结构域以及序列特征;采用MEGA4.0软件构建系统进化树;利用实时荧光定量RT-PCR技术研究该基因的表达特性。【结果】克隆了1个烟草抗病相关基因,命名为NtPsaN,该基因具有PsaN基因家族保守结构域,OFR长度507bp,编码168个氨基酸;构建了PsaN亚基系统进化树;实时荧光定量RT-PC...

【目的】马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是危害烟草、马铃薯、番茄、辣椒等主要农作物的重要病毒,给农业生产带来巨大损失。论文旨在克隆Hsc70-2蛋白在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中的基因序列并分析其生物学信息,研究NbHsc70-2蛋白对PVY侵染烟草的影响,为进一步解析PVY的侵染机制提供理论依据。【方法】以本氏烟为材料,克隆NbHsc70-2蛋白的基因编码序列(coding sequence,CDS),利用MEGA 6.0进行多序列比对并构建系统进化树;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析NbHsc70-2在本氏烟各组织中的表达水平;采用在线软件BaCeILo和SignalP 4.0对NbHsc70-2进行生物信息学分析;构建NbHsc70-2-RFP融合蛋白确定该蛋白的亚细胞定位;研究PVY处理对本氏烟叶片中NbHsc70-2的影响;利用激光共聚焦观察PVY-GFP处理对NbHsc70-2-RFP定位的影响;构建NbHsc70-2 VIGS沉默体系及瞬时表达载体,采用qRT-PCR比较NbHsc70-2在沉默/过表达后对PVY表达的影响。【结果】NbHsc70-2编码649个氨基酸,系统进化树分析表明,NbHsc70-2与普通烟NaHsc70-2序列相似性最高,亲缘关系最近,属于热激蛋白家族,C端具有热激蛋白家族的高度保守基序结构;qRT-PCR分析表明,NbHsc70-2在叶中表达量最高,在根和茎中的表达量较低;BaCeILo预测及激光共聚焦显微镜观察均显示NbHsc70-2定位在细胞质中,并且PVY-GFP侵染本氏烟后NbHsc70-2-RFP部分转移至细胞核,与PVY-GFP共定位在细胞质及细胞核中;将NbHsc70-2基因沉默载体pTRV::NbHsc70-2导入本氏烟中7 d后相比于对照组,沉默组出现心叶皱缩及矮化现象;接种PVY-GFP 7 d后通过手持紫外灯观察到沉默组中无明显绿色荧光出现,而对照组中PVY-GFP系统侵染使得非接种叶片呈现荧光现象,沉默组荧光点数约为对照组28%;接种PVY后,利用qRT-PCR检测沉默NbHsc70-2后1、3、5 d的PVY CP基因积累量,结果表明沉默NbHsc70-2后PVY CP基因积累量下降,其中3 d和5 d与对照相比差异显著,基因表达水平分别为对照的14%和0.004%;将NbHsc70-2过表达载体pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2与PVY同时导入本氏烟后,结果表明相比于对照组,过表达组48 h和72 h其PVY CP基因积累量显著上升,基因表达水平分别为对照组的2.31、2.56倍。【结论】PVY侵染会引起NbHsc70-2表达量上升;NbHsc70-2是PVY侵染本氏烟重要的组成成分,沉默该基因显著抑制PVY的表达,过表达NbHsc70-2则显著提高PVY的表达,即NbHsc70-2的表达水平与PVY复制呈正相关,NbHsc70-2蛋白促进PVY对烟草的侵染。

【目的】对21份我国生产中大面积推广使用的烟草品种和抗源材料进行烟草蚀纹病毒(TEV)和马铃薯Y病毒(PVY)的抗病性鉴定,为烟草抗病品种的利用与品种合理布局,以及烟草抗病毒病育种的亲本选择提供依据。【方法】以21份烟草品种为材料,于2009-2011年采用大田人工接种鉴定的方法,对21分烟草种质资源进行了TEV和PVY的抗病性鉴定。【结果】在供试种质中,对TEV表现抗病的有双抗70、云烟97、中烟103、秦烟96、辽烟17、云烟203、秦烟98、云烟85、G28共9份材料,表现中抗的有中烟90、龙江237、NC89、G80共4份材料,表现中感的有云烟87、RG11、净叶黄共3份材料,表现感病...

为了探明微管结合蛋白７０（ＭＡＰ７０）在抗马铃薯Ｙ病毒（ＰＶＹ）中的作用机制，克隆了烟草Ｎｔ ＭＡＰ７０基因的全长，并进行了生物信息学分析．利用实时荧光定量ＰＣＲ研究了该基因在烟草不同时期和不同部位中的表达水平，结果表明，ＮｔＭＡＰ７０在烟草的各个生长期均有表达，且在根中的表达量最高．构建了基于双生病毒卫星诱导的烟草Ｎｔ ＭＡＰ７０的沉默载体，以中国番茄黄化曲叶病毒（ｔＹＬＣＣＮＶ）为辅助病毒在烟草中沉默了该基因．与对照相比，在Ｎｔ ＭＡＰ７０基因沉默的烟草中ＰＶＹ侵染速率明显减缓，病毒含量显著降低．

设计简并引物,用RT-PCR法从马铃薯野生种(Solanum pinnatisectum)克隆到了CHS(Chalcone synthase,查尔酮合酶)基因的全长cDNA,并用半定量RT-PCR法进行了表达分析。序列分析表明,CHS基因编码一个389个氨基酸残基的多肽,在氨基酸水平上与其他茄科植物的同源性达到89%~93%,多重比较和系统发育分析均表明该基因为CHS家族中的一个新成员;检测了CHS基因的空间表达模式,该基因在花和匍匐茎中表达量最高,在根和块茎中没有检测到,这与花和匍匐茎呈淡紫色有花色苷合成,而根和块茎呈白色无花色苷合成是相一致的;发现在块茎中CHS受光诱导表达,光照后的第3天...

马铃薯是世界性粮蔬作物。致病疫霉引起的晚疫病则是马铃薯育种所面临的最严峻问题之一,因此,分离和利用马铃薯晚疫病抗性基因获得抗病新品种是马铃薯育种的重要目标。首先在连翘中发现的一类与木质素合成相关的Dirigent基因可能在植物抗病虫害过程中起重要作用。试验根据马铃薯的EST序列信息设计特异性引物,并通过RT-PCR和RACE技术获得了一条全长为729 bp的Dirigent基因cDNA序列,命名为StDIR1;该cDNA编码一个包含191个氨基酸的蛋白质多肽;系统进化分析表明,该多肽是一种Dirigent-like蛋白,属于DIR-b亚群,与陆地棉Di-rigent-like protein ...

为了解马铃薯Y病毒在贵州烟田的发生和流行规律,对2013—2015年采集到的贵州省多个烟区呈现典型茎脉坏死症状的疑似受马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)侵染的烟草样品进行单斑分离和病毒鉴定,并以现有PVY序列信息为参考,设计了4对PVY特异引物,经过RT-PCR扩增、T载体连接、序列测定以及序列拼接,并利用MEGA软件进行系统进化分析。结果发现PVY福泉分离物(PVY Fuquan isolate,PVY-FQ)和PVY大方分离物(PVY Dafang isolate,PVY-DF)为优

利用数据库资源和RT–PCR技术获得烟草WRKY8基因,序列分析表明,该基因包含1 551 bp的开放阅读框,编码516个氨基酸。基因编码的蛋白含有2个WRKY结构域,其锌指结构类型为C2H2(C–X4–5–C–X22–23–H–X1–H)。推测其可能定位于细胞核并具有复制转录及调控的功能,从而参与对植物生长发育和胁迫应答的调节。RT–PCR结果表明,NtWRKY8基因受低温诱导表达。

维生素B_6(VB_6)在植物体内参与多种生化反应,对植物生长至关重要,吡哆醛还原酶(PLR)是VB_6代谢转换的作用酶,催化吡哆醛(PL)生成吡哆醇(PN),对维持细胞内VB_6的动态平衡发挥重要作用,而PLR在植物中鲜有报道。以拟南芥Arabidopsis thaliana吡哆醛还原酶氨基酸序列At PLR1为模板,在公用数据库通过同源比对获得数条烟草Nicotiana tabacum Nt PLR1基因的片段,结合互补脱氧核糖核酸(c DNA)的末端快速扩增-聚合酶链式反应(RACE-PCR)技术获

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【目的】研究云芝葡聚糖对烟草马铃薯Y病毒(PVY)的抑制作用,为新型杀菌剂云芝葡聚糖水剂的开发应用提供依据。【方法】以PVY枯斑寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)、系统寄主心叶烟(Nicotiana glutinosa)为材料,采用枯斑法、叶圆片法及室内盆栽试验,测定云芝葡聚糖的抗PVY活性及其诱导抗病性,同时测定其对烟草防御酶POD、PAL活性的影响。【结果】云芝葡聚糖对PVY具有很强的预防作用和诱导抗性,700μg/mL云芝葡聚糖的预防效果达73.98%,诱导抗性达59.84%;对PVY有一定的钝化和抑制增殖作用,其中700μg/mL云芝葡聚糖对PVY的钝化效...

花色苷是植物次生代谢过程中产生的黄酮类物质，在花色苷合成途径中，花色苷合成酶催化无色花色苷转化成有色的花色苷，在植物器官着色过程中起重要作用。为了解彩色马铃薯花色苷合成途径中关键酶基因ANS的功能，以红皮红肉的彩色马铃薯品种红美为试验材料，利用RT-PCR技术克隆花色苷合成酶基因，通过生物信息学分析其特性，并将其过表达到拟南芥中进行功能验证。结果显示，该基因cDNA序列长为1 406 bp,包含1 368 bp完整的开放阅读框，编码455个氨基酸残基。通过生物信息学分析克隆到的基因，并将该基因命名为StANS1a,GenBank登录号为ON512347,其氨基酸序列具有保守的结构域DIOX＿N和2OG＿FeⅡ＿Oxy,分别位于氨基酸序列的52～166位和215～312位。在拟南芥中过表达StANS1a,通过半定量RT-PCR检测其转录水平，转基因株系中都有StANS1a基因的表达，且表达量较非转基因拟南芥高；通过检测转基因植株中花色苷的含量，发现转基因植株花色苷含量比非转基因植株高2.17%～54.61%,表明StANS1a参与了花色苷的生物合成。同时也证明彩色马铃薯StANS1a基因在花色苷代谢途径中起着重要的作用。

为明确马铃薯StPR1基因在抗病中的作用,构建了植物表达载体pBI121-StPR1,并通过农杆菌转化法将StPR1基因导入烟草中,采用不同的致病菌对转基因烟草进行处理,对其抗病性及生理特性进行研究,包括细菌病害软腐病(胡萝卜软腐欧文氏菌、菊欧氏菌和胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫亚种)和青枯病(茄科雷尔氏菌)、真菌病害干腐病(接骨木镰孢、燕麦镰孢)致病菌。结果表明,接种致病菌后,转基因型烟草和野生型烟草叶片上的病斑直径会随着病菌胁迫时间的延长而增大,并且转基因型烟草病斑直径明显小于野生型烟草;在生理特性分析中,野生型烟草和转基因烟草叶片中生理指标都会随着病菌胁迫时间的延长而呈上升趋势,但转基因烟草SOD、POD和CAT活性较野生型烟草均有不同程度的提高。抗病性及生理特性分析结果均表明,转基因烟草对于致病细菌和真菌均具有更强的抗性,说明StPR1基因在马铃薯植物抗病中起着重要的作用,为PR1基因在植物的抗病方面提供了理论基础。

为从分子水平鉴定山东聊城的一表现明显花叶、黄化、蕨叶及果实畸形的南瓜病毒病的病原。采用RT-PCR的方法,用TMV外壳蛋白(CP)基因的特异引物,对该样品进行了检测,克隆到的基因序列进行分析,并使其在大肠杆菌中表达。结果表明,从该样品中扩增到了TMV的CP基因,说明该样品受到TMV的侵染,首次发现TMV自然侵染南瓜。对CP基因序列测定及分析表明,与GenBank上其他TMV分离物CP基因核苷酸序列的同源性为86.5%～99.0%,推导的氨基酸序列同源性为93.7%～99.4%。根据完整CP基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:32个TMV分离物可分为5个组,其中TMV-liaocheng与Nak...

根据烟草蚀纹病毒(TEV)CP序列设计合成上下游引物,利用RT-PCR方法获得了TEV CP基因,大小为789 bp。将TEV CP基因克隆到pM D 18-T S im p le V ector,经E coRⅠ/S acⅠ双酶切得到目的片段,并将其定向插入到pET 30a载体中构建了原核表达载体pET 30-TEV CP,重组质粒经E coRⅠ和S acⅠ双酶切鉴定及基因测序验证正确后,转化大肠杆菌BL 21,用IPTG进行诱导表达。结果表明,TEV CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,分子量约为37 ku。以表达产物为抗原免疫家兔,制备了特异性抗血清,其效价为1/1 204。W ester...