【目的】鉴定烟粉虱（Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａＢａｃｉ）体内的溶菌酶基因，并对其序列特征、进化关系和表达模式进行分析，探索该基因在烟粉虱应对球孢白僵菌侵染过程中的作用，为进一步解析烟粉虱先天免疫过程提供理论依据。【方法】以第２代高通量测序的结果为依据，比对非冗余核苷酸数据库，筛选ｅ值

为了探讨重组犬溶菌酶的活性及临床应用前景,人工合成犬溶菌酶基因,构建其原核重组表达载体pPROHTa-rcLYZ,进行原核表达并对表达产物进行活性分析。结果表明,合成的犬溶菌酶基因全长396 bp,编码132 aa;构建的表达载体pPROHTa-rcLYZ含有犬溶菌基因完整的ORF;重组犬溶菌酶的相对分子质量为16 ku;重组犬溶菌酶约占全菌总蛋白32％,纯化后占全菌可溶性蛋白的95％;重组犬溶菌酶最适pH值为6．2,最适温度为38℃,对溶壁微球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有较强的溶菌活力,对铜绿假单胞菌、链球菌、枯草杆菌等有一定的抑制作用,对白色念珠菌无抑制作用,对人工感染的犬大肠...

克隆东方黏虫C型溶菌酶基因MseLYS,构建MseLYS基因的原核表达载体，检测该基因在东方黏虫不同龄期和组织的表达情况，旨在为探究MseLYS基因的功能和结构提供理论参考，也为进一步研究该基因的抗菌功能和生理机制奠定基础。以东方黏虫为研究对象，通过反转录PCR(RT-PCR)和末端快速扩增技术(RACE),获得了溶菌酶基因MseLYS的全长核苷酸序列，之后将去掉信号肽的开放阅读框架(ORF)序列连接到表达载体pET-30a(+)上，并用IPTG进行了诱导表达，最后用荧光定量PCR明确了该基因的时空表达模式。序列分析表明，此基因全长729 bp, ORF全长426 bp, 5′和3′非编码区分别为75,228 bp,共编码141个氨基酸残基，其蛋白质的等电点和分子质量分别为7.72,16.13 ku。系统进化树分析结果表明，MseLYS与其他物种的C型溶菌酶聚集在一起，且与其他昆虫的氨基酸序列具有高度一致性，表明MseLYS为C型溶菌酶。SDS-PAGE电泳结果表明，MseLYS在表达菌BL21(DE3)内表达的蛋白质分子质量与预期大小一致，约20 ku,说明MseLYS在大肠杆菌中能够高效表达。龄期表达谱分析表明，MseLYS基因在东方黏虫幼虫、雄虫和雌虫不同发育阶段表达量显著不同，在末龄幼虫、蛹中表达量较高，其他发育时期表达水平较低。组织表达分析结果表明，MseLYS基因在雄虫不同组织表达量存在着显著差异，其中脂肪体和胸内表达量较高；在雌虫不同组织表达量也存在显著差异，其中触角、翅和体壁中表达量较高。综上，成功克隆了东方黏虫C型溶菌酶MseLYS基因的全长序列，构建了该基因的原核表达载体并能够高效表达蛋白质，明确了该基因在不同组织和不同龄期的表达模式。

基于物种同源性,应用PCR和RT-PCR技术,克隆得到藏山羊瓣胃溶菌酶基因cDNA编码序列,并命名为TGOLyz,应用生物信息学软件对TGOLyz基因核苷酸序列及预测的蛋白序列进行了分析,并预测该蛋白的三级结构;应用qRT-PCR技术检测了TGOLyz在5个组织中的定量表达。结果表明,藏山羊瓣胃溶菌酶基因TGOLyz cDNA编码区长444 bp(Accession No.KC558501),编码147个氨基酸,分子量为16.29 kDa,等电点为6.08。同源性对比显示,TGOLyz与牛胃1(Cow stomach 1)的同源性最高,达95.24%,与牦牛胃(Yak stomach)的同源性...

【目的】烟粉虱（Bemisia tabaci）为世界性分布的重要农林入侵害虫，寄主植物种类众多，但对不同寄主植物存在嗜性差异，而味觉受体（gustatory receptor,GR）基因在其取食选择等行为中发挥重要作用。本研究通过克隆烟粉虱味觉受体GR1和GR2基因，明确其在烟粉虱不同发育期和成虫不同组织中的表达特性，为基因功能的深入研究提供依据。【方法】从烟粉虱MED隐种成虫头部转录组中筛选获得味觉受体基因序列，利用巢式PCR技术克隆获得两个味觉受体基因的完整开放阅读框（open reading frame,ORF）序列，两个基因分别命名为BtabGR1和BtabGR2，运用生物信息学软件对其编码氨基酸序列特征、结构域等信息进行预测，基于邻接法构建BtabGR1、BtabGR2与其他半翅目昆虫味觉受体基因的系统进化树，并利用实时荧光定量PCR方法分析两个基因在烟粉虱不同发育期（卵、1—4龄若虫和雌、雄成虫）和雌、雄成虫不同组织（头、胸、腹、足）中的表达情况。【结果】克隆获得BtabGR1和BtabGR2基因序列（GenBank登录号：OL845904和OL845905），完整开放阅读框为1 287和1 344 bp，分别编码428和447个氨基酸，预测蛋白分子量为48.54和51.50 kD，理论等电点为8.85和8.74，具有4个和6个跨膜结构域。氨基酸序列比对和系统进化分析结果显示，BtabGR1和BtabGR2与其他半翅目昆虫GR28b和GR43a-like基因亲缘关系较近。发育期表达谱分析表明，BtabGR1和BtabGR2在烟粉虱的不同发育历期均有表达，其中BtabGR1在成虫中表达量高于其他发育期，而BtabGR2在卵中的表达量最高；组织表达谱结果表明，BtabGR1和BtabGR2在烟粉虱雌、雄成虫不同组织中均有表达，且均在成虫头部高表达。【结论】BtabGR1和BtabGR2具有昆虫味觉受体基因的典型特征，二者均在烟粉虱成虫头部高表达，推测两基因在烟粉虱寄主植物适应过程中发挥重要作用，可作为烟粉虱新型防控措施的潜在靶标。

为明确烟粉虱取食ToCV侵染番茄后其生理防御反应相关基因的变化,通过转录组测序和实时荧光定量PCR技术研究烟粉虱MED隐种取食ToCV侵染番茄和健康番茄6,12,24,48 h,其体内解毒酶、保护酶系统以及基因功能、代谢功能的变化。结果表明,烟粉虱MED隐种取食ToCV侵染番茄不同时间,其体内解毒酶细胞色素P450酶(P450)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、羧酸酯酶(CarE)和保护酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)转录水平均发生不同程度的变化;除CAT外,P450、GST、CarE、SOD和POD表达量总体趋于上调,其中发挥主要作用的是P450和SOD。通过对差异表达基因进行GO注释和KEGG功能分析,发现烟粉虱MED隐种取食ToCV侵染番茄12 h,其差异基因的生物学功能和代谢途径与其他时间点不同,该时间点下烟粉虱主要通过溶酶体实现蛋白质分解,而其他时间点下烟粉虱则通过核糖体逐步实现氨基酸到蛋白质的生物合成。综上,烟粉虱取食ToCV侵染番茄可能引起了其解毒酶、保护酶基因表达的改变,并通过溶酶体途径调控自身免疫应对ToCV入侵;其中,12 h可能是烟粉虱与ToCV互作的关键时间点。研究结果有助于进一步阐明烟粉虱取食ToCV获毒后的防御机制,丰富烟粉虱-植物病毒-寄主植物间的互作理论,为田间ToCV的有效防控提供科学依据。

烟粉虱内共生菌groEL基因编码一种与植物病毒传毒相关的GroEL蛋白.以B型烟粉虱为研究对象,利用1对特异引物,对B型烟粉虱体内的groEL基因进行PCR扩增,选取502 bp groEL基因片段构建dsRNA,并将其连接植物表达载体pBIN19,将重组质粒电激转化农杆菌菌株LBA4404.采用农杆菌浸染转化本氏烟草,PCR筛选表明,目的片段已整合至转基因植株的基因组DNA;RT-PCR结果表明,502 bp的groEL基因片段在转基因植株中被转录.

为了解c型溶菌酶基因与长丰鲫(Chang Feng Carassius auratus)的抗菌效应关系,本研究利用同源克隆方法获得长丰鲫c型溶菌酶基因cDNA全长序列。结果显示:c型溶菌酶基因全长698 bp,包括5'端非翻译区60 bp,3'端非翻译区200 bp,开放阅读框438 bp,编码145个氨基酸。长丰鲫c型溶菌酶基因在肾脏组织中表达量最大,在脾脏、肠道、心脏和脑中大量表达,在肝脏和鳃中表达量相对较低,在皮肤和肌肉中几乎不表达。长丰鲫在感染迟钝爱德华氏菌、嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌后,在肝脏

本实验采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到了虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius)溶菌酶(LYZ)基因的全长cDNA序列。结果表明,虾夷马粪海胆LYZ基因全长为912 bp,含有1个480 bp的开放阅读框(ORF),编码159个氨基酸,其中第1 20个氨基酸为信号肽,蛋白计算分子量为17.69 kD,等电点为7.75。氨基酸比对分析表明,虾夷马粪海胆LYZ基因与紫球海胆(Strongylocentrotus purpuratus)和刺参(Apostichopus japonicus)的i型LYZ基因相似百分比分别为91.4%和5...

【目的】比较温度胁迫对两种生物型烟粉虱体内hsps诱导表达的差异。【方法】根据烟粉虱hsp70基因、hsp90基因和18Sr RNA序列,设计并合成引物用于实时定量RT-PCR,扩增产物连接到质粒pMD18-T载体上,重组质粒经筛选、签定和10×梯度稀释后作为模板,用于标准曲线的制作和样品检测,检测温度胁迫对B型和ZHJ-1型烟粉虱hsp70和hsp90mRNA转录水平的诱导情况。【结果】在受到34℃、37℃、40℃和43℃的高温胁迫时,两者hsps的诱导水平无显著差异(P>0.05);在受到4℃、7℃、10℃和13℃的低温胁迫时,B型烟粉虱体内hsps的诱导表达水平显著超过了ZHJ-1型烟粉...

采用PCR方法对所克隆的斑节对虾溶菌酶基因的cDNA进行改造,并克隆至含温控启动子PRPL的大肠杆菌表达质粒pBV220,构建斑节对虾溶菌酶表达载体pBV220 lyz。该质粒转化大肠杆菌后经42℃诱导表达。SDS PAGE电泳表明,表达产物中有16kD左右的特异性条带,与预期斑节对虾溶菌酶分子量相符。薄层扫描显示,重组斑节对虾溶菌酶约占全菌总蛋白的32%,纯化后的重组斑节对虾溶菌酶占全菌可溶性蛋白的90%左右。比浊法检测复性后产物的生物活性,结果表明重组斑节对虾溶菌酶的最适pH为6.0,最适温度为40℃。测定了重组斑节对虾溶菌酶对溶壁微球菌和几种鱼病原菌菌株的溶菌活力,结果表明,重组斑节对虾...

以初重为(41.26±1.09)g的暗纹东方鲀为实验鱼,配制5种玉米蛋白粉使用量为0%、5%、10%、15%、20%的实验饲料,玉米蛋白粉对饲料中鱼粉的替代水平分别为0%、7.4%、14.8%、22.2%和29.6%。用实验饲料饲养暗纹东方鲀60d,研究玉米蛋白粉替代鱼粉对暗纹东方鲀肝胰脏、头肾和脾脏组织的溶菌酶活性及其c-型溶菌酶mRNA相对表达量的影响。结果表明,(1)暗纹东方鲀肝胰脏、头肾和脾脏的溶菌酶比活力分别为9.14、42.12和40.49U/mgprot,头肾和脾脏组织中c-型溶菌酶mRNA相对表达量分别是肝胰脏的3.76和3.24倍。(2)玉米蛋白粉替代鱼粉显著影响暗纹东方鲀溶...

【目的】为深入研究植物病毒—介体昆虫—寄主植物三者互作关系及机制提供科学的理论基础。【方法】以3个不同番茄品种为供试植物,MED烟粉虱为供试昆虫及近年来发现的云南本地双生病毒的优势种PaLCuCNV和TYLCTHV为供试病毒,探究烟粉虱取食、双生病毒侵染及烟粉虱与双生病毒互作对番茄生长发育特性及SA和JA信号途径防御基因表达的影响。【结果】与对照相比,不同处理均能引起番茄植株高度、地上部鲜重和干重的降低,不同处理与不同材料之间差异较大,总体表现为烟粉虱与双生病毒互作较烟粉虱取食、双生病毒侵染对植株高度、地上部鲜重和干重的影响较大。此外,不同处理普遍引起番茄JA和SA信号途径防御基因不同程度的上调表达,只是SA信号途径基因上调幅度较JA信号途径基因的上调幅度大。【结论】植物病毒—介体昆虫—寄主植物之间的互作关系及机制复杂多样,因植物种类、昆虫种类及病毒种类的不同而不同程度地影响植物生长发育及防御基因的表达。

为研究在环境因素变化后，菲律宾蛤仔Ｉ型溶菌酶参与免疫应答反应的变化模式，实验采用ｃ ＤＮＡ末端快速扩增技术，从菲律宾蛤仔体内克隆获得了一种Ｉ型溶菌酶基因的全长ｃ ＤＮＡ序列（命名为ＲｐＩ ＬＹＺ－２），该序列开放阅读框（ＯＲＦ）为４７１ ｂｐ，编码１５６个氨基酸。ＲｐＩ ＬＹＺ－２基因在所检测组织中均有表达，其中在外套膜中表达量最高，在肌肉组织中表达量最低。采用荧光定量ｐｃＲ法，研究了不同温度［（２９±１）、（２１±１）和（１３±１）°ｃ］、盐度（３２、２２和１２）及鳗弧菌刺激对菲律宾蛤仔Ｉ型溶菌酶基因表达的影响。结果显示，在温度２１°ｃ和盐度２２胁迫处理后，ＲｐＩ ＬＹＺ－１基因的表达量呈现．．．

从鲤鱼鳃组织中分离克隆到一种新的g型溶菌酶同工型基因(CLYG).该基因的全长cDNA为558 bp,除去终止密码子,编码185个氨基酸,推断的氨基酸序列没有信号肽,含3个催化位点(谷氨酸73、脯氨酸86和天冬氨酸97),具有鱼类g型溶菌酶的基本特征.通过PCR方法在CLYG基因的5'和3'端分别引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点.扩增到的目的片段与表达载体pPICZαA连接构建重组表达载体pPICZαA-CLYG后,电转至毕赤酵母X-33,筛选得到的阳性转化子在1.0%甲醇、29℃、pH 6.0的条件下诱导