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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张桂敏 张晚鸣 何国帮 马立新
根据文献报道的烟曲霉植酸酶序列,设计引物以烟曲霉CCTCCAF93044的总DNA为模板进行梯度PCR,扩增出了1条约1.4 kb的带,将该片段进行DNA序列测定,其序列与已报道的烟曲霉植酸酶序列完全一致,但只编码完整的成熟植酸酶序列。将该片段克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K上,获得表达质粒pHBM108。该质粒转化毕赤酵母KM71所得重组子经PCR验证后进行诱导表达,其中一重组子经144 h诱导,植酸酶表达量至少为1.25 mg/ml,比同类报道的表达量高出60％以上,以植酸钠为底物测得酶活为11.17U/ml。
[期刊] 华北农学报
[作者]
宋玛丽 王茜 杜军 赵峰梅 梁爱华
对来源于大肠杆菌的植酸酶基因ａｐｐ ａ进行突变获得植酸酶基因突变体ａｐｐ ａ－２ＱＮ，利用酵母表达系统在摇瓶培养条件下表达后，该植酸酶突变体显示出良好的热稳定性。为提高该植酸酶的表达量，降低植酸酶的生产成本，对表达该酶的重组酵母菌ＧＳ１１５／ａｐｐ ａ－２ＱＮ进行了高密度发酵研究，通过控制发酵过程中碳源（甘油）的添加使得菌体生长达到一定密度，从而实现高效表达。在诱导蛋白质表达阶段，发酵液中甲醇的含量影响植酸酶的表达量，利用变色酸分光光度法对甲醇含量进行了检测分析。结果表明，在５ Ｌ发酵罐中进行高密度发酵１４７ ｈ后，菌体浓度ＯＤ６００Ｎｍ达到３１３，通过将甲醇浓度控制在２．５％左右，经过诱导１．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
宋玛丽 王茜 杜军 赵峰梅 梁爱华
对来源于大肠杆菌的植酸酶基因app A进行突变获得植酸酶基因突变体app A-2QN,利用酵母表达系统在摇瓶培养条件下表达后,该植酸酶突变体显示出良好的热稳定性。为提高该植酸酶的表达量,降低植酸酶的生产成本,对表达该酶的重组酵母菌GS115/app A-2QN进行了高密度发酵研究,通过控制发酵过程中碳源(甘油)的添加使得菌体生长达到一定密度,从而实现高效表达。在诱导蛋白质表达阶段,发酵液中甲醇的含量影响植酸酶的表达量,利用变色酸分光光度法对甲醇含量进行了检测分析。结果表明,在5 L发酵罐中进行高密度发酵147 h后,菌体浓度OD600nm达到313,通过将甲醇浓度控制在2.5%左右,经过诱导1...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
李雯 陶妍
从鲤鱼鳃组织中分离克隆到一种新的g型溶菌酶同工型基因(CLYG).该基因的全长cDNA为558 bp,除去终止密码子,编码185个氨基酸,推断的氨基酸序列没有信号肽,含3个催化位点(谷氨酸73、脯氨酸86和天冬氨酸97),具有鱼类g型溶菌酶的基本特征.通过PCR方法在CLYG基因的5'和3'端分别引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点.扩增到的目的片段与表达载体pPICZαA连接构建重组表达载体pPICZαA-CLYG后,电转至毕赤酵母X-33,筛选得到的阳性转化子在1.0%甲醇、29℃、pH 6.0的条件下诱导
关键词：
鲤鱼 g型溶菌酶 毕赤酵母 重组表达
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
唐升斌 矫庆华 谢达平
通过PCR方法扩增得到无信号肽无内含子的酸性植酸酶phyB基因,将此基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并转化毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组毕赤酵母.在甲醇的诱导下,该植酸酶phyB基因在毕赤酵母中得到表达.经SDS-PAGE凝胶电泳分析,该重组蛋白的相对分子质量为7.5×104,而该植酸酶在大肠杆菌DH5α表达系统中表达的相对分子质量为6.0×104,这可能是由于糖基化的结果.酶学性质检测发现,表达的植酸酶最适作用温度为65℃,比野生原始菌株的提高了10℃;诱导pH值为5.5时,蛋白的表达量最高,为10 528.6 U/mL,是野生菌株的2.8倍;最适作用pH值为2.5;在70...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
黄君 张昌毅 赵述淼 梁运祥
利用RT-PCR技术,提取黑曲霉(Aspergillusniger)L3的总RNA进行反转录,并通过PCR扩增得到去除天然信号肽的β-1,4-葡聚糖酶基因egⅠ,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,使之位于α-因子信号肽下游,并与之同框,构建重组表达质粒pPIC9k-egⅠ,电击转化毕赤酵母GS115,经MM、MD、CMC-Na和G418平板筛选,得到重组毕赤酵母工程菌1#和5#,在摇瓶中β-1,4-葡聚糖酶酶活分别达到1456U/mL和1928U/mL。重组酶最适温度为70℃,最适pH为5.0。
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘加爱 陈蕾 林元山 张小鹃 邹洪彬 张学文
为了以酿酒酵母S78为宿主菌异源高效表达糖化酶基因,进一步扩大糖化酶基因在工业生产上的应用。运用RT-PCR法从黑曲霉中克隆得到糖化酶基因(glaA)cDNA,去除其信号肽编码区后的序列重组到酵母表达载体pVT102U/αADH1强启动子下游,并与α因子分泌肽信号序列融合。用PEG/LiAc法将构建的重组表达载体转入酿酒酵母S78菌株,筛选出的转化菌点种到可溶性淀粉平板上培养,用碘染法鉴定重组基因的表达情况。鉴定出了典型水解圈的酵母转化子,转化子接种到YPD培养基中摇瓶培养后,取发酵上清液经SDS-PAG
关键词：
黑曲霉 糖化酶 酿酒酵母 异源表达
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
闻雅男 王学英 夏润玺 王媛媛
为获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生物生物制剂,从自行筛选的黑曲霉中提取RNA,通过反转录合成模板cDNA,根据phyA成熟肽编码序列设计出一对引物,PCR扩增phyA,对扩增片段进行了克隆,通过限制性内切酶酶切分析、DNA测序证明phyA基因克隆成功。从pBS-T-phyA克隆中获取phyA编码序列,将其与pET28a+质粒连接,构建pET28a+-phyA重组质粒,并在大肠杆菌中获得高效表达。本研究成功克隆phyA,该基因全长1404bp,以ATG为起始密码子,TGA为终止密码子,编码467个氨基酸组成的多肽。SDS-PAGE电泳结果表明,phyA在大肠杆菌中成功表达,成熟植酸酶...
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
付峰 刘荭 范万红 江育林 黄倢
根据SVCV糖蛋白基因序列设计引物,在5’引物和3’引物中分别引入酶切位点。以病毒核酸为模板用RT-PCR方法扩增该段糖蛋白基因,将所得的基因片段(517和521)克隆至穿梭载体pGAPZαA/B之GAP启动子下游位点,构建含α信号肽的重组表达载体。获得的重组质粒pGAPZαA-517和pGAPZαB-521经线性化后,电击法转化毕赤酵母SMD1168菌株,构建分泌型表达SVCV糖蛋白的重组酵母菌株。酵母菌落PCR法检测表明,已成功构建分泌表达SVCV糖蛋白的酵母基因工程菌株,斑点印迹法进一步分析表明有目的蛋白的成功表达。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
杨玉霞 张慧玲 汪艳 陈勇
为实现瘤胃细菌产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因(FsGLU)的高效表达,开发新的饲用β-葡聚糖酶资源,根据毕赤酵母对密码子的偏爱性、G+C含量等特点,对FsGLU基因进行密码子优化,然后合成优化后的1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因(FsGLUm),转化毕赤酵母GS115,以甲醇诱导表达并对重组FsGLUm的酶学特性、底物特异性和对消化酶的耐受性进行了研究。结果表明:摇瓶水平条件下,以甲醇诱导表达48 h时,重组FsGLUm酶活性提高25.1%(P
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李潇楠 王爽 王琦
为得到高表达超氧化物歧化酶毕赤酵母工程菌株,促进SOD的产业化生产,将来源于蜡样芽孢杆菌M22菌株的Mn-SOD-2基因转入毕赤酵母GS115中,构建了表达工程菌株YS 1～100。采用PTVA法(Posttransformational vector amplification)进行拷贝数扩增处理。建立了SOD重组菌株MMH(Minimal Methanol+Histidine)平板简易检测法,使用该法对转化子进行初筛,并用荧光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR)法检测部分重组酵母工程菌中外源SOD基因的拷贝数。结果表明:试验中得到80株高抗Zeocin的...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李琦 成莉凤 段盛文 冯湘沅 郑科 杨琦 刘志远 彭源德
为了获得新型木聚糖酶的高效分泌表达,在工程酶项目组前期原核表达了木聚糖酶基因xyn A的基础上,将xyn A基因(Gen Bank登录号:U57819)编码耐热性木聚糖酶成熟蛋白的部分序列克隆到p PICZαA表达载体上,转化毕赤酵母X33,成功构建真核表达体系,再分批加入0. 5%(V/V)甲醇诱导毕赤酵母工程菌株产胞外木聚糖酶。结合木聚糖酶活力检测、SDS-PAGE电泳和Western Blot分析胞外木聚糖酶表达情况。结果表明,该XynA含有典型的糖苷水解酶11类催化结构域(GH11),成熟蛋白的预测分子量为38. 6 ku,等电点为6. 86; 7个毕赤酵母基因工程菌株X33/p PICZαA-xyn A分泌的木聚糖酶活力均≥300 U/m L,最高达487. 2 U/m L;胞外木聚糖酶在SDS-PAGE和Western Blot检测的特征谱带分子量约为45 ku,均比预期分子量(38. 6 ku)略大。一种新型木聚糖酶获得了高效分泌表达,为进一步分离纯化,研究其性质、结构和功能奠定了基础。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
黄镇太 杨金玲 程克棣 朱平
凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)是氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的主要受体,它与动脉粥样硬化过程密切相关。通过RT-PCR从THP-1细胞系获得LOX-1 cDNA并被克隆到载体pPIC9K的a信号肽的下游。线性化的重组质粒转化Pichia pastoris GS115。阳性转化子经过BMMC液体培养基培养,上清液经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,出现1条在受体菌对照中不曾有的大小约43 kDa的蛋白带。重组蛋白的功能研究在进行中。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
黄鹭强 张丽萍 雷秀清 林志钦 郑宝东
以粟酒裂殖酵母基因组DNA为模版,逆转录获得cDNA;以cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增,得到苹果酸通透酶(mae1)基因,将其与pMD-18T连接并测序.结果表明cDNA全长为1316 bp,编码438氨基酸,分子质量49ku,与已报道的mae1基因序列的同源性达到99%.mae1与整合型表达质粒pSH47连接后,用重组的表达质粒转化产朊假丝酵母,经PCR验证筛选阳性克隆子.通过对转化子的摇瓶筛选,发现重组子的降酸幅度均大于原始菌株,培养40 h降解了48.6%的L-苹果酸,降解率比原始菌株提高了9.8%.
[期刊] 华北农学报
[作者]
皇甫海燕 燕孟娇 宋培玲 郝丽芬 皇甫九茹 贾晓清 李子钦
为探讨ＰＧＩＰ蛋白与ＰＧ的互作及ＰＧＩＰ基因在油菜抗黑胫菌病中的作用，根据Ｇｅｎ Ｂａｎｋ中油菜ＰＧＩＰ９、ＰＧＩＰ１５ＣＤＳ序列设计引物，并去掉信号肽序列，以接种黑胫病病原菌ＬｅＰｔｏＳＰｈａｅｒＩａ ＢＩＧＬｏＢｏＳａ（菌株ｎＭ－１）７ Ｄ后油菜叶片总ｒｎａ反转录的Ｃ Ｄｎａ为模板，ＰＣｒ扩增出ＰＧＩＰ９、ＰＧＩＰ１５除信号肽以外的编码区片段，并克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体Ｐ ＰＩＣＺαａ中构建重组质粒Ｐ ＰＩＣＺαａ－ＰＧＩＰ９、Ｐ ＰＩＣＺαａ－ＰＧＩＰ１５。重组质粒经单、双酶切、菌落ＰＣｒ筛选鉴定后热激化法转化酵母细胞ＰＭａＤ１６，再经ＺｅｏＣＩｎｔＭ的ＹＰＤ平板和菌落ＰＣｒ筛选鉴定．．．
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