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[期刊] 华北农学报
[作者]
安世恒 郭线茹 罗梅浩 蒋金炜 马继盛
利用RT-PCR技术扩增烟夜蛾(HelicoverpaassultaGuen啨e)幼虫中肠Bt毒素Cry1Ac受体蛋白APN(N-氨基肽酶,aminopeptidaseN,APN)基因片段,克隆和测序结果表明,测序得到的812bp的片段编码270个氨基酸残基,且该片段在阅读框内。通过同源性分析发现,其核苷酸序列与棉铃虫(H.armigera)、澳洲棉铃虫(H.punctiger a)、烟芽夜蛾(H.virescens)、舞毒蛾(Lymantriadispar)、小菜蛾(Plutellaxylostella)、印度谷螟(Plodiainterpunctella)RC688品系和HD198品系、烟...
关键词：
烟夜蛾 Bt 受体蛋白 cDNA 克隆
[期刊] 华北农学报
[作者]
李卫华 苗雪霞 黄勇平 安世恒 郭线茹
类钙粘蛋白位于昆虫中肠刷状缘膜囊泡上,该蛋白作为Bt毒素的受体可以与其结合导致昆虫死亡,因此,昆虫对Bt毒素的抗性与类钙粘蛋白有密切关系。本研究以烟夜蛾五龄幼虫中肠的总RNA为模板,根据已经克隆的其他昆虫的类钙粘蛋白基因序列设计引物,利用RT-PCR技术扩增出了烟夜蛾类钙粘蛋白基因的cDNA片段,将其连接到pMD18-T载体,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆并进行序列测定,测序得到的1 335 bp的片断编码444个氨基酸残基。序列分析表明,该氨基酸序列与棉铃虫和烟芽夜蛾类钙粘蛋白的一致性分别为95%和86%。研究结果对进一步研究昆虫对Bt毒素产生抗性的机制以及发展分子技术快速检测并监测田间昆虫抗性...
关键词：
烟夜蛾 类钙粘蛋白 基因克隆 序列分析
[期刊] 中国农业科学
[作者]
修伟明 董双林 苗慧 穆兰芳
通过比较几种已发表夜蛾科昆虫的信息素结合蛋白(PBP)氨基酸序列,设计合成一对简并性引物,利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术从甜菜夜蛾(SpodopteraexiguaHübner)雄虫触角扩增得到2个分别为275bp和281bp的cDNA片段SexigPBP1和SexigPBP2,其分别由92个氨基酸残基和94个氨基酸残基组成。通过在GenBank中进行序列的同源性比较,表明这2个序列与已知几种昆虫的PBP氨基酸序列具较高同源性。
关键词：
甜菜夜蛾 信息素结合蛋白基因 序列分析
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
修伟明 董双林
利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术从斜纹夜蛾(Spodoptera litura(Fabricius))雄蛾触角扩增得到2个分别为275 bp和281 bp的信息素结合蛋白(PBP)cDNA片段:SlitPBP1和SlitPBP2,其分别由92个氨基酸残基和94个氨基酸残基组成,并且具有5个保守的半胱氨酸位点(全序列应有6个)。通过在GenBank中进行序列的同源性比较,表明这2个序列与已知几种夜蛾科昆虫的PBP氨基酸序列具较高的同源性。
关键词：
斜纹夜蛾 触角 信息素结合蛋白 序列分析
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张霞 李国勋 郭巍
【目的】围食膜(peritrophic membrane,PM)是衬托于昆虫中肠内的一种无脊椎动物特有的几丁质—蛋白复合结构,它能够促进食物消化,保护消化道免受微生物入侵。昆虫肠粘蛋白(ⅡM)是其重要组分之一。因此,作为中肠防御系统的PM已成为害虫生物防治的新靶标。分离和鉴定甜菜夜蛾肠粘蛋白基因cDNA。【方法】以甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)中肠为材料,依据stratagene公司试剂盒方法,构建甜菜夜蛾中肠cDNA表达文库。依据现代免疫学原理,利用粉纹夜蛾肠粘蛋白特异性多克隆抗体(anti-ⅡMantiserum)筛选该文库。【结果】cDNA表达文库滴度为8.51×106p...
[期刊] 林业科学
[作者]
徐明 徐福元 吴小芹
【目的】通过测定Bt、灭幼脲及其混剂对美国白蛾4龄幼虫体内中肠有关生化指标的影响,探讨用混剂防治幼虫的增效机制。【方法】分别将Bt、灭幼脲及其混剂设置为5个浓度;采用生化测定法分别测定药剂对美国白蛾4龄幼虫血淋巴蛋白和中肠蛋白酶活力的影响。【结果】5个浓度的Bt、灭幼脲及其混剂处理4龄幼虫后,混剂对幼虫中肠蛋白酶、血淋巴蛋白的抑制效果均优于单剂。混剂处理6 h后,幼虫体内中肠蛋白酶活力低于对照,各浓度处理间差异显著;24 h后各浓度处理的幼虫中肠蛋白酶的活性较对照明显降低,且与处理浓度呈负相关关系,说明Bt+灭幼脲混剂处理明显抑制白蛾4龄幼虫的中肠蛋白酶活力,进而直接影响到幼虫的取食。混剂处理...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈琳 魏纪珍 刘臣 牛琳琳 张彩虹 梁革梅
【目的】研究棉铃虫(Helicoverpa armigera)中肠蛋白ABCC1(HaABCC1)与Cry1Ac的结合特性及对Cry1Ac毒力的影响,明确HaABCC1在Cry1Ac杀虫机制中的作用。【方法】分析HaABCC1基因序列,设计引物,通过原核表达得到HaABCC1两个跨膜区片段的蛋白,与Cry1Ac进行Ligand blot试验,验证其与Cry1Ac的体外结合特性;利用RNAi技术干扰棉铃虫幼虫的HaABCC1,在3龄幼虫腹部注射siABCC1,比较HaABCC1的表达量及Cry1Ac处理后棉铃虫死亡率的变化;通过细胞转染将ABCC1导入Sf9细胞系中,确定pAc-ABCC1重组质粒转入Sf9细胞后,用细胞生物测定的方法比较Cry1Ac处理后细胞死亡率的变化;比较敏感品系(96S)和Cry1Ac抗性品系(BtR)棉铃虫的HaABCC1基因全长序列,并通过荧光定量RT-PCR检测HaABCC1在抗、感棉铃虫中的表达量。【结果】HaABCC1跨膜区TMD1和TMD2在Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中成功表达,两个HaABCC1跨膜区片段蛋白均能与活化的Cry1Ac在体外结合;棉铃虫注射siABCC1后,HaABCC1的表达量显著下降,与未注射的棉铃虫、注射DEPC水和siEGFP的棉铃虫相比,用活化的Cry1Ac蛋白处理HaABCC1被干扰的棉铃虫,其幼虫死亡率显著降低,表明棉铃虫幼虫的HaABCC1被干扰后,能显著降低Cry1Ac对棉铃虫的毒力;用活化的Cry1Ac蛋白处理成功转入HaABCC1的Sf9细胞,与对照Sf9细胞相比,细胞的死亡率明显上升,表明将HaABCC1导入Sf9后能显著提高Cry1Ac处理后的细胞死亡率;抗性品系(BtR)与敏感品系(96S)棉铃虫的HaABCC1氨基酸序列没有差别,但抗性品系BtR棉铃虫HaABCC1的表达量显著降低。【结论】HaABCC1是Cry1Ac的特异性结合蛋白,可能是Cry1Ac的功能受体蛋白,并可能参与对Cry1Ac的抗性机制。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张留圈 张霄 刘媛 徐重新 张存政 谢雅晶 寇莉萍 刘贤金
【目的】通过设计并优化生物素-亲和素标记磁珠筛选策略,建立针对Cry1Ac毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法,为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法,经过4轮筛选后,对每轮筛选后抗Cry1Ac毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定,通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Cry1Ac的阳性克隆,并对其进行PCR鉴定和DNA测序,确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。利用纯化后的scFv-A12作为"捕获抗体",...
[期刊] 林业科学研究
[作者]
杨璞 陈晓鸣 朱家颖 丁伟峰 刘魏魏
采用RACE和RT-PCR对白蜡虫雌成虫β1-微管蛋白基因进行了克隆,获得的cDNA全长序列为1 492 bp,完整开放阅读框为1 341 bp,编码447个氨基酸残基,包含β微管蛋白的保守区域和GTP结合位点,理论分子量约为50.20 Kda,等电点为4.75。同源性分析表明:所获得的β1-微管蛋白与其它昆虫的β微管蛋白基因在氨基酸水平上是高度同源的,该基因cDNA序列已经递交到Genbank,获得的登录号为JF731244。
关键词：
白蜡虫 微管蛋白 RACE 氨基酸
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
刘晓柱 黄妤 彭珍子 周晶辉 洪亚辉 张学文
以烟草WS38为材料,根据GenBank中登录的烟草生长素结合蛋白(ABP1)氨基酸序列设计引物,通过RT-PCR克隆了烟草WS38ABP1基因cDNA分子编码区,序列全长为564bp,可编码1条188个氨基酸的多肽.利用ClustalX软件对该序列翻译获得的多肽序列与报道的烟草生长素结合蛋白氨基酸序列比较,两者同源性为98.4%,存在2个氨基酸的差异,但差异氨基酸对ABP1结构和功能影响微弱.认为克隆的cDNA序列即为烟草WS38ABP1cDNA,不同品种烟草ABP1基因存在的核苷酸单位点多态性(SNP)造成了两者氨基酸序列的差异.
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
韩招久 韩召军 李凤良 李忠英 陈之浩
利用简并引物 ,采用PCR等分子生物学技术 ,对小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体 (nAChR)α亚基的cDNA片段进行克隆 ,并对序列进行分析。测序结果显示 ,扩增的目的基因片段包含了nAChRα亚基的 3种亚型 (分别命名为Pxαl、Pxα2、Pxα3) ,都具有典型的α亚基的结构 :2个相邻的半胱氨酸 ,由 2个半胱氨酸之间二硫键形成包含 15个氨基酸的胞外环 ,与烟碱和α银环蛇毒素结合有关的氨基酸残基。克隆的基因片段在氨基酸序列上和其他昆虫nAChRα亚基基因之间有高达 6 5 %～ 99%的同源性 ,表明克隆的cDNA片段是小菜蛾nAChRα亚基基因的部分序列。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
古英洪 汤浩茹 张义正
【目的】克隆桃(Prunus persica)多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP)基因,并进行原核表达研究。【方法】根据李属植物pgip保守区域设计1对特异引物,以桃叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1kb的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达质粒,转化到Escherichia coli Rosetta-gami(DE3)pLysS中进行表达。【结果】测序结果显示,桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白cDNA编码区...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
吕亮 陈娇 郭志敏 吕为 陶佩文 吕惠红 潘哲群 常向前 万鹏 张舒
为明确苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)对草地贪夜蛾幼虫的防治效果,采用室内生物活性测定、田间药效试验等方法,研究和分析AcMNPV对草地贪夜蛾幼虫的杀虫活性和生防效果,结果显示,AcMNPV对草地贪夜蛾2龄幼虫的LC_(50)=2.9×10~(7 ) PIB/mL;在田间,AcMNPV+Bt复配制剂1千万苜核·苏云菌悬浮剂(1 500 mL/hm~2)药后第10天的平均虫口防效为68.99%,而药后第15天的平均防效亦有66.87%,均对草地贪夜蛾幼虫表现出较好的防治效果。应用DNAMAN 6.0软件对试验后死虫样进行DNA同源比对鉴定,结果显示polh、lef-8和lef-9基因序列同源性均达到100%。以上结果表明AcMNPV对草地贪夜蛾幼虫有较好的控制作用。建议在草地贪夜蛾低龄幼虫发生高峰期施用1千万苜核·苏云菌悬浮剂,最好选择在晴天16:00-17:00使用,避开高温和光照等不利环境条件的影响,以使病毒制剂能更好地发挥作用,提高其防治效果。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王秉宇 彭德良 黄文坤 彭焕 王高峰
以马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)为材料,用RACE方法,获得了类毒液过敏原蛋白新基因Dd-vap-2的cDNA全长(GenBank登录号为GU370352)。该cDNA全长序列为1 150 bp,包括1个912 bp的完整ORF,编码1个含303个氨基酸的蛋白,其理论分子质量为31.8 ku,等电点pI为6.76。序列比对分析表明,De-vap-2基因含有保守性结构域,属于富含半胱氨酸分泌蛋白(cysteine-rich secretory protein,CRISP)家族成员,N端具有21个氨基酸残基组成的信号肽。系统进化树分析表明,该基因与马铃薯金线虫(G...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
舒建洪 潘智芳 郑月茂 石玉强 张涌
通过RT-PCR技术从人乳腺癌组织中扩增出长度为2259 bp的人乳铁蛋白cDNA,PCR产物经凝胶回收纯化后,克隆在pMD 18-T载体的T位点。测序结果和序列分析显示,与GenBank中收录的人、小鼠、奶牛和山羊的乳铁蛋白cDNA序列的同源性分别为99．73％,82．19％,81．79％和87．28％。其中与人乳铁蛋白cDNA 序列相比,发现有5个碱基因等位基因间的突变而发生变异,1个碱基发生了未知的突变,表明已成功的扩增、克隆了人乳铁蛋白基因cDNA序列,此基因序列的GenBank登录号为AY165046。
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