扩增了炭疽芽孢杆菌PA基因,构建了原核表达质粒pET-28a-PA,并对其进行了诱导表达,对表达产物免疫原性和免疫保护效果进行了研究。结果表明,PA基因的长度约为2 205 bp,PA蛋白的相对分子质量为83 ku;rPA蛋白具有良好的免疫原性,初免后10 d即可检测到特异性抗体,第3次免疫后抗体水平明显升高,可达1∶12 800;rPA蛋白刺激小鼠产生的特异性抗体亚型以IgG 1为主;rPA蛋白在体外对小鼠脾脏细胞有促进生长和增殖作用。rPA免疫组小鼠脾脏中CD4+细胞显著增加,免疫应答趋向T h2型反应,说明rPA介导的免疫反应以体液免疫为主。rPA具有一定的免疫保护作用,保护率达到50%...

利用同源重组方法将来源于水稻细菌性条斑病菌的Harpin(HpaG Xooc)编码基因hpa1分别插入根围拮抗解淀粉芽孢杆菌FZB42的蛋白水解酶编码基因aprE和nprE位点,成功构建双拷贝Harpin表达工程菌株FZBHarpin。反转录PCR检测结果显示,hpa1能在RNA水平上正常转录表达。工程菌FZBHarpin发酵72 h后,其发酵液可引起烟草过敏性反应,这表明Harpin蛋白外泌胞外并保持生物活性。利用FZBHarpin浸种烟草后,烟草主根长达64.05 mm,比对照增加了30%,促生效果是FZB42的2倍。盆栽水稻白叶枯病防治试验结果显示,FZBHarpin防效为51.9%,比...

侧孢短芽孢杆菌G4菌株在侵染线虫的过程中可以分泌蛋白酶,降解线虫体壁,从而帮助细菌侵入宿主体内.在本文中,侧孢短芽孢杆菌的胞外蛋白酶BLG4基因经克隆后插入到改造后的枯草芽孢杆菌表达载体pWT22中,构建重组表达质粒pWT22-BLG4.构建成功的重组质粒通过化学转化法转入枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失菌株WB600中,转化子pWT22-BLG4/WB600在IPTG(1.0 mmol.L-1)的诱导下,发酵液上清中的蛋白酶活可达到620 U.mL-1,高于出发菌株G4的BLG4酶活(240 U.mL-1).经SDS-PAGE分析,重组子pWT22-BLG4/WB600产生了一条分子质量约为30 ku...

【目的】贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LJ02菌株能够诱导黄瓜等植物产生免疫抗病反应。本研究从生防菌LJ02中分离鉴定具有激发植物免疫活性的蛋白分子,通过验证其功能,进一步解析免疫蛋白的免疫信号通路。【方法】用硫酸铵沉淀法处理LJ02菌株发酵液,离心获得LJ02蛋白粗提物,将其经凝胶层析后再利用半制备高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)分离,收集不同峰值处的蛋白组分。以烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)为靶标进行活性组分的筛选,从而获得具有免疫活性的组分。液相质谱联用仪(LC-MS)检测分析活性组分后发现,在组分F-23中含鞭毛蛋白(flagellin,Flg~(LJ02))。将鞭毛蛋白Flg~(LJ02)进行原核表达并纯化,经过敏性坏死反应(hypersensitive reaction,HR)和抗病试验验证其免疫功能。为确定其主要免疫信号通路,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测水杨酸(salicylic acid,SA)和乙烯(ethylene,ET)途径的相关合成酶基因ICS1、PAL、ACS1以及免疫相关抗性基因NPR1、PR-1、EIN2和EIN3,通过免疫相关抗性基因的相对表达量解析鞭毛蛋白Flg~(LJ02)免疫信号转导途径。【结果】HPLC层析分离出贝莱斯芽孢杆菌LJ02菌液产生的60个外泌蛋白组分(F-1—F-60),免疫烟草接种TMV后,观察分析发现组分F-20、F-23、F-41、F-44具有显著的免疫抗病效应,其中组分F-23抗TMV效果最为显著,其抑制率为81.7%。经过质谱数据分析发现该组分包含鞭毛蛋白Flg~(LJ02)等7种物质。选择鞭毛蛋白Flg~(LJ02)为研究对象构建表达载体,转化大肠杆菌BL21,诱导表达后破碎细胞,获得粗提蛋白。将粗提蛋白过柱、透析纯化后的Flg~(LJ02)渗入珊西烟(Nicotiana tabacum var. xanthi)叶片,24 h后能观察到过敏性坏死反应。将Flg~(LJ02)稀释为终浓度50、100、200μg·mL~(-1)的稀释液后预处理珊西烟叶片,24 h后接种TMV,其对TMV的枯斑抑制率分别为65.6%、76.1%、88.1%。用鞭毛蛋白Flg~(LJ02)处理珊西烟,其SA途径和ET信号途径的免疫抗病相关基因ICS1、PAL、NPR1、PR-1、ACS1、EIN2、EIN3的相对表达量在24—48 h均显著上调。【结论】贝莱斯芽孢杆菌LJ02外泌的鞭毛蛋白Flg~(LJ02)可以激发珊西烟植株的免疫防御反应,提高烟草植株对TMV的抗病性。

【目的】制备抗肠致病性大肠杆菌(EPEC)的重组嗜酸乳酸杆菌,并初步探索其免疫效果。【方法】采用DNAStar软件选取EPEC E2348/69的eae全基因中抗原性较高的984bp片段(编码328个氨基酸残基,命名为eae Int328)为目标序列,以EPEC E2348/69基因组为模板,PCR扩增eae Int328基因,构建重组表达载体pSIP409-eae Int328,电转化法获得相应的重组嗜酸乳酸杆菌,采用SppIP诱导重组菌表达,并通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组蛋白。以BALB/c雌性小鼠为受试动物,灌胃重组嗜酸乳酸杆菌15d后,再灌胃EPEC,第21天...

【目的】为开发抗病基因和生物农药新资源,纯化鉴定枯草芽孢杆菌B111分泌的抗棉花黄萎病菌蛋白质,克隆其编码基因,并分析在毕赤酵母中的表达特性。【方法】通过超滤浓缩、90%硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶QAE-A50强阴离子交换柱洗脱及冻干等步骤,分离纯化抗菌蛋白。采用联机反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱,鉴定抗菌蛋白种类。克隆包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因序列,构建表达载体pPIC9K-PT,转化毕赤酵母GS115。转化子经PCR鉴定,甲醇诱导表达产物经中性蛋白酶活性和抗菌活性检测验证功能。【结果】纯化鉴定了一个来源于枯草芽孢杆菌B111的抗菌中性蛋白酶BS2。克隆了包含前导区序列在内的抗菌蛋白基...

采用Folin -酚试剂法测定在不同pH值时三株芽孢杆菌Y2 - 2、F14、Y1- 13的酶活力 ,研究细菌生长与蛋白酶活力的关系。结果表明 ,在细菌生长初期 ,蛋白酶活力较小 ,随着细菌生长进入稳定期 ,蛋白酶活力逐渐增大。在同一生长阶段 ,芽孢杆菌发酵液的蛋白酶活力随pH值的增加而增大 ,在pH值为 9时达到最大值。证明该三株菌所产蛋白酶均为碱性蛋白酶 ,其中以Y2 - 2、F14的酶活力基本相当 ,且在整个实验中测得的酶活力均比Y1- 13的酶活力大。

【背景】副结核病（paratuberculosis,PTB）是由副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis,MAP）主要引起反刍动物的一种慢性消耗性传染病。患病动物表现为肉芽肿性肠炎和肠道的功能失调、顽固性腹泻、渐进性消瘦、营养不良、贫血、嗜睡甚至死亡。PTB给畜牧业造成巨大的经济损失，并且严重威胁公共卫生安全。由于目前临床上对于PTB的检测和控制手段不够完善，现有的PTB疫苗保护效果不佳，并且干扰牛结核病的诊断，因此亟需研发免疫原性强、保护效果佳的疫苗以用于PTB的防控。【目的】通过筛选MAP免疫原蛋白，并对其免疫保护效果进行评价，为PTB的防控提供数据支持。【方法】根据MAP的p22、map1272c、map3531c、map3783、map3701c以及map3527这6个基因，分别构建5种重组质粒，在获得5种重组蛋白基础上，联合MONTANIDE ISA 61 VG佐剂皮下多点注射免疫小鼠，通过IFN-γ ELISPOT试验筛选出最佳免疫原；随后将最佳免疫原和已报道的66NC融合蛋白混合，经皮下多点注射免疫小鼠，在二免3周后用1×10~8 CFU的MAP K-10菌株腹腔感染小鼠。通过IFN-γ ELISPOT试验，抗体监测和细胞因子检测，分析感染后小鼠的体重、肝脏病理学和组织病理学变化及其荷菌数差异，综合评价候选亚单位疫苗的免疫原性和免疫保护效果。【结果】以MAP p22、map1272c、map3531c、map3783以及map3701c为基础成功构建和表达了5种融合蛋白58F、62F、69F、46F和52F，其中免疫58F后产生的IFN-γ水平最高，是更具潜力的候选免疫原，且以融合蛋白组合66NC+58F诱导持久高滴度的IgG、IgM、IgG1和IgG2a水平，诱导特异性的IFN-γ、TNF-α和IL-17A的释放；在保护效果评价中，融合蛋白组合66NC+58F抵抗MAP感染造成的体重下降，显著减轻肝脏的病理损伤，降低MAP在肝脏中的定植。【结论】融合蛋白组合66NC+58F诱导小鼠产生Th1和Th17型免疫反应，对MAP感染有着一定免疫保护作用，是PTB重要的候选亚单位疫苗。

【目的】优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)启动子和表达宿主,构建其高效的表达系统,为重组枯草芽孢杆菌的研究和应用奠定基础。【方法】以β-半乳糖苷酶编码基因为报告基因,以诱导型的枯草芽孢杆菌麦芽糖操纵元启动子为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒为载体骨架,构建枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,将其电转化到B.subtilis 1A747菌株后进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。利用同源重组的方法,用枯草芽孢杆菌组成型启动子P43替换了B.subtilis野生型菌株1A747麦芽糖操纵元的上游调控序列,得到优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,将pGJ222...

[目的]通过给母猪口服表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的重组枯草芽胞杆菌以评估其产生的乳源性免疫力,从而为仔猪提供相应的保护。[方法]分别给母猪口服2 mL重组枯草芽胞杆菌(1×10~9 CFU·mL~(-1))和肌肉注射2 mL灭活PEDV疫苗(1×10~7 TCID_(50)·mL~(-1)),产后1 d收集相应的样品。首先检测了乳汁中特异性SIgA及乳汁细胞中特异性IgA,然后对口腔和鼻腔分泌物中特异性SIgA和细胞因子(INF-γ和TGF-α)的水平进行了检测;最后评估乳汁中的中和抗体滴度。[结果]口服重组枯草芽胞杆菌后乳汁中SIgA及其乳汁细胞中IgA特异性抗体水平显著提高(P<0.05,P<0.01),同时乳汁及其乳汁细胞中INF-γ和TGF-α的水平也显著提高(P<0.05,P<0.01);鼻腔和口腔分泌物中特异性SIgA显著增加(P<0.05,P

研究了饲料中添加酵母培养物(益康XP)和芽孢杆菌(Bacillus)制剂对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)生长、肌肉成分、蛋白酶活性和免疫功能的影响。在基础饲料(对照组)中分别添加0.075%益康XP、0.100%益康XP、0.200%芽孢杆菌,饲养均重(5.57±0.21)g的凡纳滨对虾45 d。结果表明,添加0.075%益康XP、0.100%益康XP、0.200%芽孢杆菌分别提高凡纳滨对虾增重率17.24%、12.29%、20.18%,降低饲料系数14.28%、9.77%、12.03%,提高蛋白质效率16.49%、10.05%、12.98%(P<0.05);添加酵母培养...

为获得副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5的分段表达产物,并对各片段的免疫学性质进行鉴定。采用生物信息学软件分析Omp P5全长基因,设计3对分段引物,PCR分别从HPS汕头分离株(H0801)Omp P5中扩增出P5F1、P5F2和P5F3基因片段,构建于pET-32a(+)原核表达载体上,并将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE分析蛋白表达情况。将蛋白纯化后,利用ELISA及Western Blot分别鉴定其免疫原性及抗原性。结果表明,扩增得到的Omp P5的3个基因片段与预期大小相符合,基因测序结果与GenBank公布的序列一致,经SDS-PAGE分析,3...

【目的】明确虫生真菌球孢白僵菌(Beauveria bassiana)疏水表面结合蛋白HsbA(hydrophobic surface binding protein A)的致病过程。【方法】对HsbA进行克隆、亚克隆和原核表达,根据纯化后的蛋白制备多克隆抗体并进行抗原性分析,利用免疫电镜对HsbA蛋白进行定位观察。【结果】原核表达系统成功诱导了白僵菌的HsbA融合蛋白,制备多克隆抗体经Western杂交分析表明,该多抗能特异性识别目的蛋白。免疫电镜结果显示,HsbA蛋白在孢子和菌丝中呈随机分布。正常生长状态下,菌丝中的HsbA蛋白数量要明显多于孢子中被标记的数目,此外,孢子在侵染状态和正常生...

以北京、大连和日本3个产地的纳豆产品为试验材料,从中筛选可用于畜禽生产的纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)蛋白酶高产菌株。先通过酪蛋白平板初筛得到9株芽孢杆菌,再以N1型纳豆芽孢杆菌为模式菌株,对初筛得到的菌株进行菌落和菌体形态观察、生理生化鉴定,确定有5个菌株为纳豆芽孢杆菌。测定5个菌株48 h发酵液中蛋白酶活性,结果表明:菌株NB1为蛋白酶高产菌株,发酵液中蛋白酶活性为19.41 U.mL-1,产蛋白酶特性在6代内可保持稳定。

益生菌，因其既无毒副作用和残留问题，又能促进生长、防病治病，还可改 善养殖水体的环境，越来越受到现代水产养殖业的重视。为探究益生菌对氨氮胁迫下半滑舌鳎的非特异性免疫酶活、血液生化指标及相关基因表达是否具有调节作用，实验首先选用枯草芽孢杆菌Y2为益生菌对半滑舌鳎进行饲喂，然后对半滑舌鳎进行氨氮胁迫，胁迫过程中持续饲喂Y2并对相关指标进行监测。其中宏观生长指标结果显示氨氮胁迫组半滑舌鳎体重体长低于非氨氮胁迫组，且在氨氮胁迫及非氨氮胁迫条件下Y2组舌鳎体重体长高于空白组。免疫酶活测定结果显示，氨氮胁迫后半滑舌鳎血清过氧化氢酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）、过氧化物酶（POD）、碱性磷酸酶（AKP）活性均有所升高；且在氨氮胁迫及非氨氮胁迫条件下饲喂Y2菌株的2组ACP、CAT、和POD活性均高于其相应对照组。血液相关生化指标结果显示，非氨氮胁迫Y2组半滑舌鳎血清中白蛋白（ALB）和球蛋白（GLB）含量略高于对照组，白球比较高，甘油三酯（TG）、胆固醇（CHO）含量差异较小；氨氮胁迫对照组舌鳎血清中ALB、CHO含量下降，GLB含量略有升高，血清中总蛋白（TP）及总脂肪呈下降趋势，且白球比降低，而氨氮胁迫Y2组比空白组舌鳎血清中ALB、TG及CHO含量升高，导致白球比升高。同时氨氮胁迫使血清中丙二醛（MDA）、谷草转氨酶（AST）及谷丙转氨酶（ALT）的含量显著升高，Y2在氨氮胁迫及非氨氮胁迫条件下均可以降低MDA、AST及ALT的含量。相关基因表达结果显示，氨氮胁迫使半滑舌鳎肠、肝脏、肌肉及鳃组织热休克蛋白基因（HSP70）及血红蛋白α1基因（Hb-α1）表达量升高，且HSP70的表达量Y2组高于空白组，其中在肝脏组织中上调最明显，相反氨氮胁迫下Y2组的Hb-α1表达量下降，在肝脏及肌肉组织中下降最明显。此外氨氮胁迫使半滑舌鳎相应组织中生长因子（IGF）的表达量均降低，但在氨氮及非氨氮胁迫条件下Y2组的IGF表达量均高于其空白对照组。综上，Y2可以改善氨氮胁迫对半滑舌鳎的免疫能力、血液生化指标、氧气运输、应激能力及生长等造成的多方面影响，降低氨氮胁迫对半滑舌鳎造成的负面作用。在水产养殖行业中具有良好的应用前景。