[目的]水通道蛋白是细胞膜内嵌蛋白超家族的主要成员,具有传输水分子以及小分子化合物进出细胞膜的功能,本研究目的是分析重要农业害虫灰飞虱体内水通道蛋白功能及其与杀虫剂代谢之间的关系。[方法]根据转录组数据,采用PCR和RACE技术对灰飞虱体内的水通道蛋白基因进行了克隆,并利用进化树对获得的基因进行亲缘关系的分析验证,利用实时荧光定量PCR技术分析这些基因在灰飞虱抗、感品系间的表达量差异,利用体外表达技术分析其转运活性。[结果]从灰飞虱体内克隆获得了6个灰飞虱水通道蛋白基因全长序列,分别命名为LsAQP1、L

克隆了灰飞虱的1个保幼激素结合蛋白(JHBP)基因,命名为LstrJHBP(GenBank登录号:JF728808)。该基因全长1 514 bp,开放阅读框编码289个氨基酸,5'和3'UTR区分别为124和522 bp,预测的相对分子质量为32 599,等电点5.47。综合信号肽预测、氨基酸序列比对及聚类分析结果,推测LstrJHBP是一个细胞质JHBP。qRT-PCR测定表明,LstrJHBP在灰飞虱若虫5个龄期及雌雄成虫均有表达,但4龄若虫期显著高于其他龄期,雌雄成虫间没有显著差异。研究结果为进一步明确灰飞虱的发育及变态调控机制奠定了基础。

【目的】克隆鉴定褐飞虱（Nilaparvata lugens）丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin2，探明其表达模式和生物学功能。【方法】基于褐飞虱转录组数据，利用PCR技术克隆Nlserpin2全长cDNA序列；利用生物信息学手段分析其核酸和蛋白序列特征；通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测其在褐飞虱不同发育时期（卵、1—5龄若虫和雌雄成虫）和初羽化雌成虫不同组织（脂肪体、肠道和卵巢）中的表达，以及病原真菌金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）侵染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式；利用RNAi技术探明Nlserpin2基因沉默对褐飞虱5龄若虫存活率及抵御金龟子绿僵菌侵染能力的影响。【结果】Nlserpin2 cDNA序列（GenBank登录号：KC355239）全长1 209 bp，编码402个氨基酸，含有serpin蛋白超家族所具有的典型serpin结构域和RCL区，且N端包含一段由27个氨基酸残基组成的信号肽。系统进化树分析表明，Nlserpin2与半翅目其他昆虫的serpin聚为一支，其中与白背飞虱（Sogatella furcifera）serpin亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明，Nlserpin2表达具有明显的时空特异性，其在褐飞虱成虫中的表达量显著高于其他龄期，且在雄成虫中表达量最高；卵和低龄若虫（1—3龄）中Nlserpin2的表达量显著低于高龄若虫（4—5龄），其中3龄若虫期最低；Nlserpin2在褐飞虱雌成虫肠道、脂肪体和卵巢中均有表达，且肠道中表达量显著高于脂肪体和卵巢。金龟子绿僵菌诱导2 d和3 d后Nlserpin2的表达量显著上调，但随着诱导时间的增加，Nlserpin2表达量呈回稳趋势。RNAi分析结果显示，显微注射ds Nlserpin2可显著抑制Nlserpin2的表达水平。干扰Nlserpin2后褐飞虱5龄若虫的存活率以及对金龟子绿僵菌侵染的抵御能力均显著降低。与对照组相比，Nlserpin2干扰的褐飞虱在金龟子绿僵菌侵染5 d和8 d后的校正存活率分别下降了28.4%和31.0%，且均达到显著水平。【结论】Nlserpin2在褐飞虱防御病原真菌侵染过程中发挥重要作用，可作为应用RNAi技术防控褐飞虱的潜在靶标和褐飞虱高毒力病原真菌遗传改良的资源基因。

为探明杀虫剂在褐飞虱和灰飞虱间的作用差异,在室内测定了噻嗪酮和氨基甲酸酯杀虫剂速灭威、异丙威对褐飞虱和灰飞虱的毒力,同时比较了相同配比下噻嗪酮与速灭威、异丙威混配对两种飞虱的增效作用差异;并通过生化测定比较了杀虫剂单剂及组合对两种飞虱体内AChE和GSTs的抑制效果。研究结果表明噻嗪酮、速灭威和异丙威对灰飞虱1L若虫的LC50分别是褐飞虱的2.30、5.60、1.61倍。噻嗪酮与速灭威、异丙威分别按2∶1、1∶4比例混配,对褐飞虱的共毒系数分别为182.39和193.94,对灰飞虱的共毒系数仅为60.11和43.77。生化分析结果显示,杀虫剂单剂及组合在活体和离体条件下对褐飞虱的AChE的抑制...

【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白(tropomyosin,Tm)能与水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因(Tm),将其在原核细胞中进行表达,纯化Tm蛋白,免疫大白兔并制备其多克隆抗体,为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框(open reading frame,ORF)。提取灰飞虱总RNA,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF,连接至pMD-18T载体后进行测序...

根据已知Btcry8类基因的全长序列设计一对特异性引物JJX5和JJX3,以Bt菌株B-DLL的质粒DNA为模板扩增出3.5 kb大小的片段;将该片段插入大肠杆菌表达载体pET-21b中,并完成了该片段的全序列测定。该基因编码区为3 495 bp,编码的蛋白质由1 164个氨基酸残基组成,相对分子质量为131.8 kDa,等电点为pH 4.71,为弱酸性蛋白。该基因(GenBank:EU047597)编码的氨基酸序列与Cry8Ea1的氨基酸序列同源性高达99.31%,被国际Bt基因命名委员会正式命名为cry8Ea2。经IPTG诱导后该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达130 kDa...

【目的】通过分析克隆得到的番茄水通道蛋白SlAQP基因的cDNA全长序列特征、编码蛋白的细胞定位及其在番茄材料Mirco Tom中经干旱胁迫后的表达模式,为进一步研究番茄在逆境下的抗逆机制及加快番茄抗逆育种积累资料。【方法】采用RACE技术克隆番茄水通道蛋白基因的cDNA全长,结合生物信息学软件分析该基因的编码蛋白特性;利用基因枪转化法将SlAQP基因与GFP融合的瞬时表达载体(SlAQP::GFP)转入洋葱表皮细胞,对该基因进行亚细胞定位;利用Real time-PCR分析该基因在番茄品种Mirco Tom中经干旱胁迫下的表达机制。【结果】SlAQP基因(GenBank登录号:HQ43333...

【目的】分析辣椒水通道蛋白基因CaAQP的序列特征,并研究其在抗寒品种P70中经4℃低温胁迫处理后的表达模式,为探讨辣椒的耐寒机理及辣椒品种耐寒性改良积累资料。【方法】利用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并以4℃低温胁迫处理不同时间的抗寒品种P70为材料,利用Realtime-PCR分析所克隆基因在辣椒低温胁迫前后的表达模式,以25℃处理为对照。【结果】在4℃低温胁迫处理后的耐寒辣椒品种P70叶片中分离到与水通道蛋白基因相关的差异表达片段,并利用RACE技术克隆得到该基因的全长cDNA,命名为CaAQP,登录号为GU116569。序列分析表明,该...

【目的】明确灰飞虱（ＬａｏｄｅＬｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅＬＬｕｓ ＦａＬＬéｎ）鞘氨醇激酶（ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ，ｓｋ）的分子特征，研究ｓｋ在携带水稻条纹病毒（ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ，ｒｓｖ）与健康灰飞虱两个种群的时空表达及其对杀虫剂胁迫的响应。【方法】利用ｐｃｒ技术克隆灰飞虱ｓｋ（Ｌｓｓｋ）基因序列；使用荧光定量ｐｃｒ（ｑｒｔ－ｐｃｒ）技术分析Ｌｓｓｋ在带毒种群与健康种群灰飞虱１—５龄若虫及成虫期的表达差异，并检测该基因在雌雄虫头、唾液腺、中肠、马氏管、卵巢和精巢等组织中相对表达量；采用手动微量点滴仪将３种杀虫剂（吡虫啉、噻嗪酮和溴氰菊酯）点滴于灰飞虱４龄若虫中胸．．．

以本实验室分离的Bt菌株B-DLL质粒DNA为模板,利用cry8类基因特异性引物JJX5和JJX3扩增出3.5kb的片段,将该片段插入克隆载体pMD 18-T中,筛选获得一个含新基因的克隆pMD-cry8new。序列测定表明,该基因编码区为3 525 bp,编码的蛋白质由1 174个氨基酸残基组成,理论分子量为133.05 kDa,等电点为pH4.69,为弱酸性蛋白。该基因核苷酸序列已在GenBank登录(Accession number:HQ174208),编码的氨基酸序列与Cry8Fa1的同源性最高达99.8%,被国际Btδ-内毒素命名委员会正式命名为Cry8Fa2。将cry8Fa2基因插...

分别于 2 0 0 0年和 2 0 0 1年测定了桂林、安庆和东台 3地区褐飞虱、白背飞虱对 10种杀虫剂的敏感性 ,并分析了两种飞虱对杀虫剂的敏感性差异。结果表明 ,在年度间和地区间 ,其敏感性差异不显著 ,而药剂间的差异显著。吡虫啉和醚菊酯是毒力最高的两个药剂 ,但吡虫啉的个体一致性较差 ,明显低于醚菊酯。合理利用这两个药剂 ,可以作为避免单一药剂长期使用、延缓抗性发展和延长药剂使用寿命的良策。

用4种生物测定方法测定了7种杀虫剂对越南九龙江褐飞虱种群的毒力。稻茎浸渍法测定结果表明:7种杀虫剂对褐飞虱3龄若虫的毒力(LC50值)大小顺序为氟虫腈>吡蚜酮>噻虫嗪>噻嗪酮>毒死蜱>吡虫啉>叶蝉散;点滴法测定结果表明:5种杀虫剂对褐飞虱雌成虫的毒力(LD50值)大小顺序为噻虫嗪>氟虫腈>吡虫啉>毒死蜱>叶蝉散;浸苗法测定结果表明:7种杀虫剂对褐飞虱3龄若虫的毒力(LC50值)大小顺序为氟虫腈>吡蚜酮>噻虫嗪>噻嗪酮>毒死蜱>叶蝉散>吡虫啉;药膜法测定结果表明:7种杀虫剂对九龙江褐飞虱3龄若虫的毒力(LC50值)大小顺序为氟虫腈>叶蝉散>毒死蜱>噻虫嗪>吡蚜酮>吡虫啉>噻嗪酮。由此可见,目前氟...

【目的】研究黑麦草在逆境胁迫下水分代谢的基因调控,克隆黑麦草质膜型水通道蛋白基因的全长cDNA序列,并对其表达模式进行研究。【方法】利用RACE技术从黑麦草(品种"顶峰")中获得LpAQP全长cDNA序列;运用生物信息学软件分析其编码蛋白;构建LpAQP与GFP融合的瞬时表达载体,采用基因枪法转入洋葱表皮细胞,观察其细胞定位;通过real time-PCR分析LpAQP的表达模式,并用Southern杂交分析其拷贝数。【结果】克隆获得LpAQP的cDNA序列,GenBank登录号为JX569791,其开放阅读框(ORF)为867 bp,编码288个氨基酸,蛋白质分子量为30.7 kD。该基因含...

为研究NIP5-1基因(Nodulin26-like intrinsic protein)在百合生长发育方面的作用机理,利用RACE技术克隆得到百合NIP5-1基因的全长cDNA序列。运用多个软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及RT-PCR技术检测其表达特性。结果表明:1)百合NIP5-1基因全长为1 492bp,包含1个900bp的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF),共编码299个氨基酸;2)百合NIP5-1蛋白属于跨膜通道蛋白MIP超家族。具有

克隆马尾松Ｐｉｎｕｓ ｍａｓｓｏｎｉａｎａ水通道蛋白（ａＱＰ），并对其生物信息学与干旱胁迫表达模式进行分析。采用逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）以及互补脱氧核糖核酸（Ｃ Ｄｎａ）末端快速扩增（ＲａＣＥ）方法克隆马尾松水通道蛋白基因。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Ｑ ＲＴ－ＰＣＲ）分析其在干旱胁迫下的响应模式。结果克隆到一个马尾松水通道蛋白基因，命名为Ｐｍ ＰｉＰ１（ＧＥｎ Ｂａｎｋ登录号为ｋＦ５８２０３８）。此基因Ｃ Ｄｎａ全长序列为１ ３０１ ＢＰ，包括８６７ ＢＰ的完整开放阅读框，９９ ＢＰ的５′末端非翻译区和３３５ ＢＰ的３′末端非翻译区。编码２８８个氨基酸残基，分子量为３０．８６．．．