为获得灰葡萄孢的致病相关基因并研究其基因功能,筛选灰葡萄孢的T-DNA插入突变体库,获得了一株致病力增强的突变体BCt98。利用PCR和Southern Blotting技术,对突变体BCt98进行鉴定。利用TAIL-PCR技术结合生物信息学方法,确定了突变体BCt98中T-DNA插入位点位于BC1G_07014.1基因的第3个外显子上。利用RT-PCR技术,确定了突变体BCt98的突变基因为BC1G_07014.1。突变体BCt98生长速度较快,菌落颜色较浅,菌丝较为致密,不产生分生孢子和菌核,且胞壁降解酶(PMG、PG和Cx)及毒素活性较野生型明显增强。表明BC1G_07014.1基因在灰...

Tri12是镰孢菌Fusarium编码单端孢霉烯族毒素(trichothecenes,以下简称“单族毒素”)输出泵的基因,而产毒基因Tri5编码的单端孢霉二烯合酶催化毒素生物合成中的第一步反应。以禾谷镰孢FusariumgraminearumSchw.野生型菌株NRRL29169为亲本,获得Tri12敲除的转化子MT12。与NRRL29169相比,MT12在PDA培养基上生长慢,生长量小(P<0.01),大分生孢子较长。致病力测定结果显示,NRRL29169致病力最强,所致病害可以自接种点向上下扩展至其他小穗,而MT12的致病力极弱。我们由此推测,Tri12的敲除导致病菌产生的毒素不能被泵出体...

【目的】揭示灰葡萄孢犬尿氨酸单氧酶基因BcKMO(kynurenine 3-monooxygenase)调控病菌致病力的机制,阐明灰葡萄孢致病的分子机理。【方法】利用DNS和Hoffman方法,对BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183和回复突变体(BCG183/BcKMO)的多聚半乳糖醛酸酶(PMG)、果胶酶(PG)、纤维素酶(Cx)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)和果胶甲基反式消除酶(PMTE)的活性进行分析;提取灰葡萄孢野生型和BCG183、BCG183/BcKMO突变体的粗毒素并进行生物活性测定;利用溴百里酚蓝显色试验,对突变体BCG183和BCG183/BcKMO的产酸能力...

通过对籼稻美香占经空间诱变筛选出的低直链淀粉含量突变体MLA-1进行遗传分析及分子生物学研究,发现MLA-1与高直链淀粉含量材料杂交的F2籽粒群体直链淀粉含量呈现一对等位基因3:1分离模式,且低直链淀粉籽粒均表现为半透明胚乳性状,F2代植株中低直链淀粉含量植株、中等直链淀粉含量植株及高直链淀粉含量植株的分离比例为1:2:1;而MLA-1与糯稻"荆香糯"杂交的F2代单株自交穗出现糯粒穗、杂合(糯粒和半透明粒)穗及半透明籽粒穗三种类型,比例为1:2:1.选用180对微卫星引物对MLA-1和对照美香占进行SSR分析,有22.8%的扩增产物在两个材料间表现出了多态性,第6染色体短臂上与Wx基因紧密连锁...

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的拟轮枝镰孢ATMT(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠(cefotaxime sodium,Cefo)和氨苄青霉素钠(ampicillin sodium,Amp)对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B(hygromycin B)的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性基因(HPH)的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150μg·mL~(-1)时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150μg·mL~(-1)时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP(登录号:LC420351.1)的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。

【目的】为了探究矮化突变体AS98发生变异的分子生物学机制,【方法】本研究利用正常陆地棉品种LHF10W99(简称LHF)与AS98杂交后代分离出的正常表现型植株和极端矮化表现型植株,在现蕾期提取2种株型的茎尖、茎和根的RNA,利用cDNA-AFLP技术分析2种植株茎尖的表达差异。【结果】筛选到差异表达的片段32条,对这32条片段进行克隆测序,利用生物信息学进行分析发现其中一条(HD61)与拟南芥的阿拉伯半乳聚糖蛋白的同源性较高。用棉花的阿拉伯半乳聚糖蛋白(Gh AGP)的序列设计引物,用RT-PCR方法

【目的】筛选苹果树腐烂病菌T-DNA插入表型或致病突变体,为研究该病菌的表型及致病相关基因提供起始材料。【方法】从建立的T-DNA插入突变体库中,随机挑选230株突变体菌株进行表型观察及致病性测定,并对部分致病突变体进行TAIL-PCR侧翼扩增。【结果】大部分的突变体与野生型菌株03-8在表型及致病性方面无明显差异,仅30.87%的突变体表现出了明显的变化;其中16株突变体(占突变体总数的6.95%)致病性发生了明显的增强,而表型与03-8相比无明显的变化;20株突变体(占突变体总数的8.69%)致病性与03-8无显著性差异,但是表型发生了明显的变化;16.1%的突变体则同时表现出表型及致病性...

采用转座子Tn5插入突变技术,共获得5 261个接合子。通过马铃薯软腐快速筛选和PCR检测验证,获得267个使马铃薯软腐能力丧失或下降的Tn5插入突变体,并测定其在水稻上的致病力和烟草上的过敏性坏死反应(HR)。结果表明:在267个突变体菌株中,对水稻无致病力的有71个,其中在烟草上无HR反应的有59个,产生HR反应的有12个;对水稻致病力下降的有68个,其余突变体菌株对水稻致病力与野生菌株差异不明显。另外,267个突变体菌株中有146个无HR反应,其中有90个对水稻无致病力或者致病力下降。致病力的分析结果表明,获得的突变体是由Tn5插入Dickeya zeae染色体上不同的致病相关基因位点导...

【目的】对水稻叶片早衰突变体es5进行遗传分析及精细定位,探索水稻叶片衰老的分子机制。【方法】es5是嘉禾212经EMS诱变获得的一个叶片早衰突变体。利用es5与籼稻中恢8015杂交获得F1,F1自交获得分离群体F2。在杭州和海南观察F1和F2的表型,并分析该突变表型的遗传行为。取F2中隐性单株,利用图位克隆方法精细定位该基因。抽穗期时对突变体和野生型叶片进行SOD活性、MDA含量、可溶性蛋白含量、叶绿素含量、净光合速率测定、组织化学分析、透射电镜观察以及衰老相关基因的表达量分析。成熟后调查es5和嘉禾2

谷子叶色突变体是探究叶绿体发育机制和C4光能利用率的理想材料之一。为了研究谷子叶色突变的分子机制,从谷子主推品种长农35号的甲基磺酸乙酯(EMS)诱变库中筛选鉴定到一个苗期条纹叶突变体wsl2,通过表型鉴定、遗传背景检测和遗传分析,同时利用MutMap方法快速精细定位突变基因,并根据突变位点开发共分离分子标记等方面对该突变体进行研究。结果表明,wsl2在苗期表现为条纹叶表型,但从拔节期开始恢复为正常叶片表型;wsl2与野生型遗传背景相同且wsl2受一个隐性核基因控制;MutMap精细定位的关联区间内包含9个非同义突变基因,其中,Seita.9G561800是一个编码与叶绿体相关的PsbP蛋白基因,含有6个外显子和5个内含子,在第1外显子77 bp处发生G/T碱基突变,导致一个精氨酸(R)突变成亮氨酸(L)。根据突变碱基设计了dCAPS标记MRI498-1(Cac8Ⅰ)和共分离标记MRI501-3,进一步验证了wsl2突变体的候选基因突变位点。研究鉴定了一个新的条纹叶突变体wsl2,对PsbP基因光合作用反应机制的进一步研究奠定了理论基础,丰富了谷子叶色突变体资源,同时验证了MutMap方法克隆谷子突变基因的有效性。

【背景】低致病性H7N9病毒自2013年在我国首次出现以来,研究发现其对家禽均呈现低致病力,对哺乳动物模型小鼠也不表现任何的致病力。但是,2015年在湖南分离的1株低致病性H7N9病毒(简称HuN/S40726),却对哺乳动物小鼠表现为高致病力。分析、推测导致该病毒对哺乳动物致病力改变的原因可能在于该病毒PB2蛋白E627V的改变。【目的】为了揭示该病毒致病力的变化原因以及对哺乳动物致病性增强的机制,提供人类H7N9病毒感染、危害增强风险预警,展开该研究。【方法】选取2013年低致病性H7N9病毒代表株(简称SH/S1053)和上述湖南HuN/S40726病毒,开展了哺乳动物致病力对比试验以及可能导致病毒发生致病力变化的相关基因位点对比分析。然后以HuN/S40726病毒为模式毒株,利用反向遗传学技术,成功建立了病毒的反向遗传操作系统;利用基因点突变技术定点突变了HuN/S40726病毒PB2蛋白的627位氨基酸,救获了重组病毒r HuN/S40726、r HuN/S40726-PB2/627E和r HuN/S40726-PB2/627K。通过小鼠感染模型评估了以上3株重组突变病毒对哺乳动物的致病力,分析了PB2蛋白627位氨基酸的突变对小鼠致病力的差异。然后通过构建HuN/S40726病毒及其突变病毒的聚合酶复合表达质粒系统,以SH/S1053病毒为背景毒株构建聚合酶复合表达质粒系统作为对照,使用双荧光素酶法检测了PB2蛋白627位氨基酸的不同突变体在293T细胞中的聚合酶活性,进一步分析PB2蛋白627位氨基酸影响病毒毒力的内在机制。【结果】通过哺乳动物致病力对比试验以及可能导致病毒发生致病力变化的相关基因位点对比分析,推测导致HuN/S40726病毒对哺乳动物致病力改变的原因可能在于该病毒PB2蛋白E627V的改变。重组救获病毒和突变株对小鼠致病性试验结果显示,PB2蛋白E627V的改变显著的增强了HuN/S40726病毒对小鼠的致病力,使得病毒MLD50由≥6.5 log10EID50变化为3.5 log10EID50,病毒毒力增强了至少1 000倍以上。聚合酶活性试验结果表明,无论是在33℃还是37℃下,PB2蛋白E627V的改变,显著提高了HuN/S40726病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性,与病毒对小鼠的致病性增强呈正相关性。【结论】PB2蛋白627位氨基酸(V)决定了HuN/S40726病毒对小鼠的高致病力。PB2蛋白E627V的改变能够显著增强HuN/S40726病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性,是引起HuN/S40726病毒对哺乳动物致病力的重要因素。

【目的】建立适合于大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)致病性相关突变体的快速筛选体系,为突变库中与致病性相关突变体的系统筛选和鉴定提供技术支撑。【方法】棉花幼苗接种于5.0×104、5.0×105、5.0×106、5.0×107和5.0×108孢子/m L的孢子悬浮液30 min,通过病情指数调查明确引起棉花黄萎病发生的病原菌浓度范围;对培养于培养瓶的大丽轮枝菌分别加入15、25、35和45 m L的灭菌水,利用血球计数板检测洗脱的孢子浓度,明确不同体积灭菌水对洗脱孢子悬浮液浓度的影响;以保存于96孔板的突变体为单位,在培养皿上进行单孢分离并挑取单个孢子于培养瓶中扩繁培养,培...

选用辣椒自交系‘6421’作为构建突变体库的试验材料,分析甲基磺酸乙酯(EMS)处理对辣椒种子萌发和幼苗生理特性的影响,确定适宜的EMS诱变浓度,在此基础上构建辣椒突变体库,并对突变体库中突变群体的表型变异进行分析。结果表明:EMS质量分数为1.0%时,辣椒种子发芽率和幼苗成活率分别为41.01%和49.32%,接近半致死剂量,且该浓度下辣椒幼苗中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性均达最大值,分别为246.45 U/g、33.99 U/g和158.10 U/(g·mi

在水稻Lemont×Dular的重组自交系群体(RILs,F10)中发现了裂颖突变体(split rice glume,srg).利用扫描电子显微镜观察野生型水稻和裂颖水稻的颖花原基分化情况,结果发现,突变体水稻的幼穗在形成内、外稃原基后,有些颖花在形成浆片后并不是直接发育形成雄蕊原基,而是在外稃或内稃原基内侧又分化出浆片原基;有些颖花原基从中间缢裂,缢裂的颖花原基又分别形成类稃片的结构,颖花发育后期,6枚雄蕊发育畸形,并且观察到不同数目的雄蕊.同时以突变体作母本,Dular、Lemont为父本配制杂交组合进行遗传分析,F2表型和χ2测验结果表明,该突变性状受单基因隐性控制.

为明确灰葡萄孢致病基因BcKMO与病菌MAPK信号途径之间的关系,利用MAPK信号途径特异性的抑制剂U0126处理灰葡萄孢野生型菌株BC22、BcKMO基因的T-DNA插入突变体BCG183和回复突变体BCG183/BcKMO。结果发现,突变体BCG183对抑制剂U0126不敏感,受抑制的程度显著低于野生型和回复突变体。对BcKMO基因与MAPK信号途径关键基因bmp1和bmp3的表达规律进行分析,结果发现,BcKMO与bmp3均是在7 d的菌丝和菌核中表达水平较高,BcKMO与bmp1、bmp3基因均是在含蔗糖和果糖培养基上培养的病菌中表达水平较高。利用Real-time PCR技术,检测BcKMO基因突变对bmp1、bmp3基因表达的影响以及bmp1、bmp3基因突变对BcKMO基因表达的影响,结果发现,突变体BCG183中bmp1的表达水平均显著高于野生型和回复突变体,bmp3的表达水平显著低于野生型和回复突变体; bmp1的RNAi突变体中BcKMO基因表达水平显著高于野生型,而bmp3基因的RNAi突变体中BcKMO基因表达水平显著低于野生型。结果表明,BcKMO基因负调控bmp1的表达,正调控bmp3的表达;而bmp1负调控BcKMO基因的表达,bmp3正调控BcKMO基因的表达。研究结果可为阐明灰葡萄孢BcKMO基因调控病菌生长、发育和致病力的机制奠定基础。