【目的】揭示灰葡萄孢犬尿氨酸单氧酶基因BcKMO(kynurenine 3-monooxygenase)调控病菌致病力的机制,阐明灰葡萄孢致病的分子机理。【方法】利用DNS和Hoffman方法,对BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183和回复突变体(BCG183/BcKMO)的多聚半乳糖醛酸酶(PMG)、果胶酶(PG)、纤维素酶(Cx)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)和果胶甲基反式消除酶(PMTE)的活性进行分析;提取灰葡萄孢野生型和BCG183、BCG183/BcKMO突变体的粗毒素并进行生物活性测定;利用溴百里酚蓝显色试验,对突变体BCG183和BCG183/BcKMO的产酸能力...

【目的】明确灰葡萄孢(Botrytis cinerea)犬尿氨酸单加氧酶基因Bc KMO与病菌c AMP信号途径之间的关系,为进一步阐明Bc KMO调控灰葡萄孢生长、发育和致病力的分子机制打下基础。【方法】利用c AMP信号途径特异性抑制剂SQ22536,检测灰葡萄孢野生型BC22、Bc KMO的T-DNA插入突变体BCG183和回复菌株BCG183/Bc KMO对c AMP信号途径特异性抑制剂的敏感性;分别提取灰葡萄孢野生型BC22、突变体BCG183和回复菌株BCG183/Bc KMO中的c AMP,利用HPLC检测各菌株中c AMP的含量;利用real-time PCR技术检测Bc KMO与c AMP信号途径中c AMP依赖的蛋白激酶(PKA)的催化亚基基因pka1和pka2、调节亚基基因pka R、编码异源三聚体G-蛋白Gα亚基基因bcg2和bcg3在病菌不同发育阶段、组织部位以及培养条件下的表达规律;利用real-time PCR技术检测Bc KMO突变体中c AMP信号途径关键基因pka1、pka2、pka R、bcg2、bcg3的表达水平;利用real-time PCR技术检测c AMP信号途径关键基因pka1、pka2、pka R、bcg2、bcg3的RNAi突变中Bc KMO的表达水平。【结果】灰葡萄孢Bc KMO的T-DNA插入突变体BCG183对c AMP信号途径特异性抑制剂SQ22536不敏感,受抑制的程度明显低于野生型BC22和回复菌株BCG183/Bc KMO。Bc KMO的T-DNA插入突变体BCG183中c AMP含量明显低于野生型菌株BC22和回复菌株BCG183/Bc KMO。Bc KMO与c AMP信号途径中c AMP依赖的蛋白激酶(PKA)的催化亚基基因pka1、编码异源三聚体G-蛋白Gα亚基基因bcg2和bcg3的表达规律基本一致,均为在7 d的菌丝和菌核中表达水平较高;此外,Bc KMO和c AMP信号途径关键基因pka1、pka2、pka R、bcg2、bcg3均为在含果糖培养基上培养的病菌中表达水平较高。Bc KMO的T-DNA插入突变体BCG183中c AMP信号途径关键基因pka1、pka2、pka R、bcg2、bcg3的表达水平均明显高于野生型BC22和回复菌株BCG183/Bc KMO。pka1、bcg2的RNAi突变体中Bc KMO表达水平明显高于野生型,而pka2、pka R、bcg3的RNAi突变体中Bc KMO表达水平明显低于野生型。【结论】Bc KMO负调控c AMP信号途径关键基因pka1、pka2、pka R、bcg2、bcg3的表达;c AMP信号途径关键基因pka1、bcg2负调控Bc KMO的表达,而c AMP信号途径关键基因pka2、pka R、bcg3正调控Bc KMO的表达。

为明确灰葡萄孢致病基因BcKMO与病菌MAPK信号途径之间的关系,利用MAPK信号途径特异性的抑制剂U0126处理灰葡萄孢野生型菌株BC22、BcKMO基因的T-DNA插入突变体BCG183和回复突变体BCG183/BcKMO。结果发现,突变体BCG183对抑制剂U0126不敏感,受抑制的程度显著低于野生型和回复突变体。对BcKMO基因与MAPK信号途径关键基因bmp1和bmp3的表达规律进行分析,结果发现,BcKMO与bmp3均是在7 d的菌丝和菌核中表达水平较高,BcKMO与bmp1、bmp3基因均是在含蔗糖和果糖培养基上培养的病菌中表达水平较高。利用Real-time PCR技术,检测BcKMO基因突变对bmp1、bmp3基因表达的影响以及bmp1、bmp3基因突变对BcKMO基因表达的影响,结果发现,突变体BCG183中bmp1的表达水平均显著高于野生型和回复突变体,bmp3的表达水平显著低于野生型和回复突变体; bmp1的RNAi突变体中BcKMO基因表达水平显著高于野生型,而bmp3基因的RNAi突变体中BcKMO基因表达水平显著低于野生型。结果表明,BcKMO基因负调控bmp1的表达,正调控bmp3的表达;而bmp1负调控BcKMO基因的表达,bmp3正调控BcKMO基因的表达。研究结果可为阐明灰葡萄孢BcKMO基因调控病菌生长、发育和致病力的机制奠定基础。

【目的】明确灰葡萄孢BcKMO在病菌生长、发育和致病过程中的功能,为阐明该基因调控灰葡萄孢生长、发育和致病的分子机理奠定基础,并为灰霉病的防治提供理论依据。【方法】利用生物信息学方法,对BcKMO及其编码产物进行分析。扩增BcKMO的编码区,与pBARKS1-eGFP载体连接,构建基因的表达载体pBARKS1-BcKMO-eGFP;利用PEG介导的原生质体转化方法,转化BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183的原生质体;利用PCR、Southern blotting和real-time PCR技术,对所获得转化子进行鉴定;对野生型菌株BC22、突变体BCG183和回复突变体BCG183/B...

为获得灰葡萄孢的致病相关基因并研究其基因功能,筛选灰葡萄孢的T-DNA插入突变体库,获得了一株致病力增强的突变体BCt98。利用PCR和Southern Blotting技术,对突变体BCt98进行鉴定。利用TAIL-PCR技术结合生物信息学方法,确定了突变体BCt98中T-DNA插入位点位于BC1G_07014.1基因的第3个外显子上。利用RT-PCR技术,确定了突变体BCt98的突变基因为BC1G_07014.1。突变体BCt98生长速度较快,菌落颜色较浅,菌丝较为致密,不产生分生孢子和菌核,且胞壁降解酶(PMG、PG和Cx)及毒素活性较野生型明显增强。表明BC1G_07014.1基因在灰...

为构建灰葡萄孢犬尿氨酸单加氧酶(Bc KMO)基因的原核表达载体并进行高效表达,获得纯化的Bc KMO蛋白。以灰葡萄孢野生型BC22为试材,通过反转录PCR扩增Bc KMO基因,回收Bc KMO基因片段克隆到p MD19-T载体中,测序正确后,酶切p MD19-T-Bc KMO和带有GST标签蛋白的p GEX4T-1质粒,将目的片段进行连接,构建Bc KMO基因的原核表达载体p GEX4T-1-Bc KMO-GST。经酶切和测序鉴定正确后,将构建好的原核载体转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导,在大肠杆菌

为了探究人参灰霉病新流行成因，对来源不同寄主和地区的１６株灰葡萄孢（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）菌株的生物学特性及致病力进行比较。结果表明：供试菌株在ＰＤａ和Ｐｓａ培养基上生长较好，ＰＪａｒ１、ＰＪａＬ３、ＰｙｃＬ１和ＰＪＬＬ１最适培养基为Ｐｓａ，ＦｓｙＬ１、ＰＪａＬ１、ＰＪａＬ２、ＰｙＬＬ１、ＰＢＬＬ１、ＰＱａＬ１、ＰＨＬＬ１和ＬｓｙＦ１最适培养基为ＰＤａ，其余菌株最适培养基为查氏培养基；菌丝生长温度范围均为５～２５℃，ＦｓｙＬ１、ＰＪＬＬ２、ＰｒＨＬ１、ＰＨＬＬ１和ＬｓｙＦ２最适生长温度为２５℃，其余菌株在２０℃时生长最快；供试菌株在Ｐ Ｈ值３～１１的范围内均能生长，ＰｙｃＬ１和Ｌｓ．．．

葡萄霜霉病是葡萄生产中最为严重的病害,为明确我国不同地区葡萄霜霉病菌致病力及遗传多样性,采用叶盘接种法测定采自19个省(市)的69株葡萄霜霉病菌的致病力,并使用SRAP标记技术对其遗传多样性进行分析。结果表明:不同地区的菌株间存在一定致病力分化现象,供试的69株病原菌中55%属于弱致病力菌株,36%属于中等致病力菌株,经接种后,3个寄主品种病情指数范围为0.56～88.89。根据病原菌对不同寄主的致病力,将菌株划分为弱、中、强、最强致病力4类,东北、西南和西北地区的弱致病力菌株占总数比例58%以上,华北、华东和华中地区中等致病力菌株为优势病原群体,华北和华中地区未出现强致病力菌株。对供试的69株葡萄霜霉病菌进行遗传多样分析,分析结果表明:SRAP标记扩增共得到条带269条,其中多态性条带267条,多态性比率达99.19%。聚类分析结果表明:供试菌株之间存在遗传变异现象,在相似性系数0.622处,69个菌株被聚类为5个类群,但未发现遗传分化与地理分布具有明显相关性。通过对全国19个省(市)的葡萄霜霉病菌的致病性和遗传变异情况进行综合分析,发现葡萄霜霉病菌致病力与遗传变异之间的关系较为复杂,并不是互相对应的关系,有关葡萄霜霉病菌致病力与遗传分化之间的关系尚需进一步研究。

【目的】由葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌引起的溃疡病是葡萄生产上的重要病害之一,在国内多个葡萄产区发生,严重威胁葡萄的产量及品质。本研究对葡萄溃疡病菌(Lasiodiplodia theobromae)中一个假定外泌蛋白LtGH61A进行功能分析,为进一步解析葡萄溃疡病菌的致病机理及病害防控提供理论依据。【方法】通过SignalP 4.0预测LtGH61A蛋白的信号肽;氨基酸序列同源比对结合基因功能注释,预测LtGH61A蛋白的功能;通过酵母互补试验分析LtGH61A蛋白的外泌特性;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析LtGH61A在病原菌营养菌丝及侵染寄主不同阶段的表达量;借助RNA干涉(RNAi)对LtGH61A进行表达抑制;通过葡萄枝干离体接种试验,分析LtGH61A蛋白对葡萄溃疡病菌致病力的影响。通过比较菌落直径,分析LtGH61A蛋白对葡萄溃疡病菌菌丝生长速率的影响。【结果】信号肽预测表明LtGH61A蛋白N端具有一个长度为18个氨基酸的信号肽;基因功能注释推定LtGH61A的编码产物属于糖苷水解酶61(GH61)家族,能酶解纤维素类物质;互补蔗糖酶外泌缺陷型酵母YTK12结果表明,LtGH61A蛋白的信号肽具有外泌活性,能够引导酵母YTK12蔗糖酶的外泌;与营养菌丝阶段相比,LtGH61A的表达量在病原菌侵染阶段显著升高,并且在接种后48 h高达营养菌丝阶段的19倍;通过RNAi试验及qRT-PCR验证,获得了2个LtGH61A表达量明显降低的阳性转化子,分别命名为RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2;葡萄枝干离体接种试验结果显示,与野生型CSS-01s相比,RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2转化子在葡萄枝干形成的病斑长度显著变短,约为野生型CSS-01s的55%,表明LtGH61A影响葡萄溃疡病菌的致病力;菌落直径比较显示,与野生型CSS-01s相比,RNAi-LtGH61A1和RNAi-LtGH61A2转化子的菌落直径变小,约为野生型85%,表明LtGH61A影响葡萄溃疡病菌的菌丝生长速率。【结论】LtGH61A影响葡萄溃疡病菌的致病力及生长速率;LtGH61A蛋白能够分泌至胞外;LtGH61A在病原菌侵染阶段的表达量显著升高,推测其通过发挥自身酶活功能,破坏寄主植物组织,从而促进病原菌的侵染。

从灰葡萄孢ATMT突变体库中筛选获得一株不产生菌核的突变体,并利用TAIL-PCR技术获得插入位点的侧翼序列,将其在灰葡萄孢基因组数据库中进行Blast比对分析,采用分子生物学技术,对突变菌株BMH174鉴定并获得其突变基因(BC1G_06945.1);并对突变体的形态学、生长速率、分生孢子产量、致病能力、胞壁降解酶活力、毒素的生物学活性等方面进行了研究,这将为深入了解灰葡萄孢的致病机制奠定基础。

【目的】揭示AtBT4在拟南芥抗灰葡萄孢中与SA、JA信号途经的相互关系。【方法】利用RT-PCR技术,检测用SA、SA类似物BTH、JA、ACC及灰葡萄孢处理拟南芥野生型Col-0后其AtBT4的表达情况;检测经SA和JA处理后拟南芥SA、JA途径相关突变体AtBT4的表达情况;并检测接种灰葡萄孢后拟南芥野生型Col-0、bt4突变体和回复突变体抗病相关基因的表达情况。【结果】JA处理和接种灰葡萄孢后,拟南芥野生型Col-0中AtBT4的表达明显增强。但经JA处理后,JA不敏感突变体jar1的AtBT4表达变化趋势与野生型明显不同,AtBT4的表达水平不受JA诱导。SA信号途径相关突变体ed...

利用同功酶电泳技术对采自国内的23个玉米弯孢叶斑病菌菌株进行可溶性蛋白以及SOD、EST、PPO、MDH、POD等酶系分析,发现不同菌株间存在差异;对菌株进行聚类分析,结果表明,在连锁距离0.36上将所有菌株聚合在一起,大致可以分成7个组,与病菌致病性分组有些一致或相近,但也有些不同或关系不密切。

本研究从400余株灰葡萄孢ATMT转化子中筛选到产孢缺陷菌株BCG-183。利用CTAB法提取野生型和BCG-183的基因组DNA,Southern杂交证实T-DNA标记在突变菌株中为单拷贝插入;对该菌株表型进行分析,发现BCG-183菌株菌落呈白色,菌丝产量较野生型大;致病性较野生型强;利用血球计数板计算产孢量,表明BCG-183不产生分生孢子;胞壁降解酶活性比野生型强。利用TAIL-PCR技术确定T-DNA插入位点侧翼序列,生物信息学分析表明,T-DNA插入到灰葡萄孢基因组超级重叠群42(Supercontig 42)中假定蛋白编码基因(BC1G_07455)的3'末端。RT-PCR结果表...

为探究苹果树腐烂病菌β-葡萄糖苷酶基因VmGluI的序列特征及其在病菌侵染致病过程中的表达,以强致病力菌株LXS080601为材料,利用RT-PCR技术克隆基因c DNA序列,通过生物信息学软件对VmGluI编码蛋白的系统进化关系、理化性质和二级结构进行分析,采用实时荧光定量PCR技术测定VmGluI的表达量。结果显示,苹果树腐烂病菌VmGluI的开放阅读框为1 689 bp(GenBank登录号KY646110),编码562个氨基酸,蛋白分子量62.7 k Da。VmGluI编码的蛋白具有糖基水解酶1家

[目的]测定稻曲病菌(UStilaginoidea vireas)的产孢稳定性、产孢能力与致病力的相关性及在水稻品种上的致病性分化。[方法]采用液体培养和人工接种的方法对采自全国9个省(市)的150个稻曲病菌菌株进行产孢能力及田间致病力测定。[结果]3次产孢试验中产孢量标准偏差小于10.0的菌株有132个,占总数的88.0%。接种于两优培九(感病品种)的平均病情指数为67.7,其中98个菌株病情指数大于50;接种于淮稻5号(中等抗病品种)的平均病情指数为21.8;接种于武育粳3号(抗病品种)的平均病情指数为16.1,其中113个菌株病情指数小于25。稻曲病菌的产孢量与致病性呈正相关,但相关系数...