为进一步研究ＪｓＷＲＫＹ１的生物学功能，构建ＪｓＷＲＫＹ１的植物超表达载体并转入烟草中过表达。再生的ＪｓＷＲＫＹ１转基因烟草与野生型烟草在表型上无明显差异。ＪｓＷＲＫＹ１过表达上调了转基因烟草体内几个防卫相关基因ＭｎｓＯＤ、Ｃｕ／Ｚｎ ｓＯＤ、Ｃｎ、ｎＡＤＰＨ ＯｘｉＤＡｓｅ和ＰＲ１的转录水平。与野生型烟草相比，ＪｓＷＲＫＹ１转基因烟草体内的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶活性在正常生长以及胶孢炭疽菌接种后均显著增强。平板抑菌试验结果显示，ＪｓＷＲＫＹ１转基因烟草叶片总蛋白对病原真菌葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌、胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌的菌丝生长具有不同程度的抑制作用。此外，用胶孢炭疽．．．

为了研究异源过表达Atvip1基因的高粱对盐碱胁迫的耐受性及相应生长情况,采用NaHCO_3∶Na_2CO_(3 )为5∶1,75 mmol/L,pH值9.63的盐碱胁迫液在高粱三叶一心期处理,在胁迫0,4,12,24,72,120 h对根系的生长指标、叶绿素含量、抗氧化酶活性以及MDA含量进行测定。结果表明:异源过表达Atvip1基因能缓解盐碱胁迫对高粱幼苗生长的伤害,可使幼苗根表面积和根体积增大,根尖数和分叉数增多,高粱主根褐化出现较晚且症状轻,侧根发生早且数量多,在72 h后仍能保证新叶正常伸展,对地上部生长影响较轻。过表达Atvip1基因可提高转基因高粱根系抗O_2~(-·)活力,降低MDA的含量,抗氧化酶活性增强;胁迫早期(4～12 h),SOD、CAT和GR作用明显;胁迫中期(24～72 h),所有酶均发挥作用;胁迫后期(120 h),CAT和GSH-PX起重要作用。盐碱胁迫差异转录组分析中,差异表达基因COG分析表明,防御机制在不同时间段中占比较大,获得抗氧化酶相关差异表达基因42个。异源过表达Atvip1基因可通过缓解盐碱胁迫对光合作用和生长发育的影响,降低活性氧破坏及膜损伤来提高转基因高粱对盐碱胁迫的抗性。

【目的】大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的ds RNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累。PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因。本研究利用转基因技术,将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆,研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响,

【目的】NAC转录因子是一类具有多种生物功能的新型转录因子,在植物抗逆响应中发挥着重要作用。本文旨在克隆并研究细叶百合LpNAC6基因在逆境胁迫下的表达模式,探究其在烟草中响应盐胁迫的功能。【方法】本研究采用同源克隆技术克隆得到细叶百合LpNAC6基因,利用生物信息学软件对LpNAC6基因进行分析;通过基因枪法对LpNAC6蛋白进行亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR的方法分析LpNAC6基因在不同非生物胁迫和不同组织中的表达模式;构建植物表达载体pBI121-LpNAC6-GFP转化烟草,通过对转基因烟草进行盐胁迫处理验证LpNAC6基因的功能。【结果】LpNAC6基因长909 bp,编码302个氨基酸,存在一个高度保守的NAM结构域,属于NAC基因家族。LpNAC6为不稳定亲水性蛋白,无信号肽和跨膜结构域,有5个糖基化位点和20个磷酸化位点,亚细胞定位在细胞核。LpNAC6基因与黄褐棉的NAC转录因子进化关系最近。细叶百合中LpNAC6基因对ABA、干旱、低温及盐胁迫均有响应。盐胁迫下,过表达LpNAC6基因的转基因烟草其SOD、POD、CAT的活性和叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白的含量均显著高于野生型。【结论】细叶百合LpNAC6基因能够响应ABA、干旱、低温、盐胁迫等非生物胁迫,其过表达能够提高转基因烟草在盐胁迫下的代谢活力和抗氧化酶活性,从而增强烟草耐盐性。

【目的】通过转基因烟草验证茶树CsCBF1基因抗寒性功能,为发掘、筛选茶树重要功能基因提供理论依据。【方法】利用根癌农杆菌介导法将构建的表达载体pBI121-CsCBF1导入烟草,通过PCR、RT-PCR和GUS活性染色鉴定外源CsCBF1基因是否导入并整合到烟草基因组上转录表达。然后将转pBI121-CsCBF1型、转pBI121型和野生型烟草分别置于25,4和0℃下处理48h后,检测其膜质通透性、丙二醛(MDA)含量和叶绿素荧光参数Fv/Fm,并将0℃处理3d的转pBI121-CsCBF1型和野生型烟草置于25℃下培养1周后观测恢复表型和统计死亡率。【结果】成功构建表达载体pBI121-C...

【目的】SAP(stress-associated protein)是一类涉及胁迫应答和调控的锌指蛋白。克隆并分析其对逆境胁迫应答的反应,为棉花抗逆育种提供候选基因。【方法】通过电子克隆方法并经RT-PCR验证获得棉花锌指蛋白基因GhSAP1,将带有目的基因的载体质粒通过PEG介导转化棉花叶肉原生质体细胞,瞬时表达分析其编码蛋白的特性及亚细胞定位信息。通过qRT-PCR技术分析目标基因的组织表达特征及非生物胁迫条件下的表达特性。通过农杆菌介导叶盘转化法,经组织培养获得转基因烟草进行异位表达,检测其与抗逆相关的生理指标,证明其提高植物抗逆能力。【结果】GhSAP1 ORF长度为543 bp,编码...

【目的】中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus, CWMV)是引起小麦黄花叶病的重要病原之一。获得表达CWMV外壳蛋白(coat protein, CP)的转基因烟草Nicotiana benthamiana(OECP)并分析其抗病性,为培育小麦抗病材料奠定工作基础。【方法】利用体外重组DNA技术构建含有CWMV外壳蛋白基因的表达载体,并通过农杆菌介导的转化方法,获得OECP。进一步利用Western Blot和PCR检测明确CWMV的外壳蛋白在OECP中能够正常的表达。【结果】部分转基因阳性植株出现矮化表型。此外,OECP阳性植株接种CWMV后7 d的定量分析表明,OECP中CWMV运动蛋白的表达量显著受到抑制。【结论】在烟草中表达CWMV的CP蛋白基因可显著增强烟草对CWMV的抗病性。图3表1参17

为了研究二穗短柄草BdDREB1-like基因在转基因烟草中的功能,克隆了该基因,并进行了生物信息学分析。该基因开放阅读框684 bp,编码228个氨基酸,编码蛋白的分子量为24.178 ku,只含有一个典型的AP2结构域,属于AP2/EREBP(APETALA2/ethylene-responsive element binding protein)超家族的DREB家族。多序列比对与进化分析显示它与黑麦ScCBFI的亲缘关系较近。亚细胞定位分析表明,BdDREB1-like基因定位于细胞核。将其构建到植物表达载体上,并通过农杆菌介导法转入烟草中。PCR和RT-PCR筛选鉴定显示BdDREB1-like基因不仅整合到烟草基因组中而且还能稳定表达。过氧化氢胁迫条件下,转BdDREB1-like基因烟草幼苗具有较高的发芽率。为了进一步确定BdDREB1-like基因与氧化胁迫的关系,又对一个月大的转基因烟草进行氧化胁迫(MV,甲基紫精)处理。结果表明,在正常生长条件下,T3转基因株系除了SOD含量外,测定的其他各种生理指标均与野生型无显著差异,T1转基因株系中只有POD和叶绿素含量与野生型中的有显著差异;而在氧化胁迫处理条件下,转BdDREB1-like基因的烟草植株相对于野生型具有较高的过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶和叶绿素的含量和较低的丙二醛和过氧化氢含量。这些结果表明,过表达BdDREB1-like基因增强了植物对氧化胁迫的耐受性。

为科学防控草莓炭疽根腐病,本研究在调查全国12个草莓主产区的109株草莓根部腐烂样品的基础上,对导致草莓根部腐烂的病原菌进行菌落形态鉴定、分离纯化与分子鉴定、多基因序列(ITS-ACT-GAPDH-CALTUB2-CHS)联合鉴定以及致病性鉴定。结果表明:109株草莓根部腐烂样品中有27.5%的样品是由草莓炭疽根腐病病原菌胶孢炭疽菌复合种(Colletotrichum gloeosporioides complex)引起;胶孢炭疽菌复合种可分为3种生理小种,分别为暹罗炭疽菌(C.siamense)、隐秘炭疽菌(C.aenigma)与果生刺盘孢菌(C.fructicola);3种炭疽菌致病力由高到低依次为隐秘炭疽菌、果生刺盘孢菌和暹罗炭疽菌。其中隐秘炭疽菌发病较快,引起的病症较重。综上,本研究可为草莓炭疽根腐病病害防控提供有价值的信息。

【背景】黄瓜易感多种病害，特别是枯萎病和白粉病，化学药物防治虽然有效但因残留高和不易降解而被限制使用，培育广谱、持久抗病的黄瓜品种是解决这一难题的根本策略。病程相关基因非表达子1(nonexpressor of pathogenesisrelated genes 1,NPR1)是系统获得性抗性（systemic acquired resistance,SAR）中的关键调控因子，参与调控多种防御相关基因的表达，影响植物的抗病能力。【目的】在黄瓜中过表达AtNPR1，探究转基因黄瓜对枯萎病和白粉病的抗性，为培育抗病能力更强、更持久的黄瓜品种提供试验依据。【方法】通过克隆拟南芥AtNPR1，构建AtNPR1过表达载体，利用农杆菌介导法转化黄瓜，获得过表达AtNPR1的转基因黄瓜植株，利用实时荧光定量PCR方法测定转基因植株中相关防御基因的表达量。选择T_0代转基因植株进行枯萎病的抗性鉴定，T_1代转基因植株进行白粉病的抗性鉴定，测定转基因植株接种枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）和白粉病菌（Golovinomyces cichoracearum）后，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化物酶（peroxidase,POD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）等抗氧化酶活性变化及丙二醛（malondialdehyde,MDA）、活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量的变化。【结果】成功获得8株T0代转基因植株，OE#4和OE#5为AtNPR1高表达植株，OE#3为AtNPR1低表达植株；通过对转基因植株中相关防御基因的表达量分析发现，过表达AtNPR1的转基因植株中多个相关防御基因表现更强、更快的表达，并且防御基因的表达量与AtNPR1在转基因植株中的表达量呈正相关。其中，PR1、PR4和WRKY70的表达量上调极为显著。转基因植株的抗病性鉴定结果表明，在枯萎病和白粉病的胁迫下，转基因植株表现出更显著的抗性，发病缓慢、症状轻微，病斑面积显著低于野生型（WT）植株。转基因T_0代植株OE#4和OE#5在接种枯萎病菌3 d后未出现明显病斑，接种7 d后出现灰褐色病斑，但未呈现萎蔫等状态；WT植株在接种3 d时出现灰褐色病斑并且轻微萎蔫，7 d时叶片出现严重萎蔫。接种白粉病菌7 d后，T_1代植株OE#2和OE#7和WT植株均出现病斑，但OE#2和OE#7植株病斑面积显著低于WT植株；接种15 d后WT植株出现叶片黄化失绿，而转基因植株OE#2和OE#7病情较轻。与WT植株相比，接种病原菌后，转基因植株中MDA含量较低，SOD、POD、CAT活性保持较高水平，ROS含量累积较少。【结论】黄瓜中过表达AtNPR1可以提高黄瓜对枯萎病和白粉病的抗性。

在烟草质体中应用来源于玉米的复合型顺式表达元件驱动来源于Isoptericola variabilis的新型耐草甘膦EPSPS基因AroA_(I.va*)的表达,使其在叶片及非绿色组织中同时高效表达。对获得的同质化质体转化植株进行转录及蛋白水平分子检测,结果表明:AroA_(I.va*)基因在转基因植株叶片及根部组织中均得到有效表达;达到同质化的烟草转基因植株pLSZ3#2和pLSZ3#3的T_0代种子可耐受高于12 mmol/L(2 000 mg/L)的草甘膦处理,在温室中培养的转基因植株可耐受1 800 mg/L剂量的草甘膦喷施处理。野生型与转基因植株的正反交实验证实通过质体转化获得的草甘膦抗性转基因植株具有母性遗传的特点。

将水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)编码HarpinXoo的hrfA基因及其N-末端缺失突变基因AB分别连接到双元载体pBI121上,构建成转基因载体,并经冻融法转化土壤杆菌EHA105。采用叶盘法转化烟草,用卡那霉素抗性筛选再生植株。通过PCR扩增检测了转化烟草中的靶基因序列及35S启动子序列,对T1代PCR阳性植株进行了PCR-Southern杂交和RT-PCR分析。结果显示,外源基因已经整合到转基因烟草基因组中,并在转录水平正常表达。用从转hrfA基因和AB片段的烟草中提取的可溶性蛋白注射烟草都能引起过敏反应,说明目的基因在转基因烟草中...

为探讨马尾松PmMYB169基因耐低磷胁迫功能,在前期克隆PmMYB169全长序列的基础上,构建pBWA(V)HS-PmMYB169-GLosgfp载体,在烟草中对PmMYB169基因进行亚细胞定位;通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,分析转基因植株对低磷胁迫的抗性。结果表明:PmMYB169基因在细胞核中行使功能;遗传转化获得22株转基因植株,对表达量较高的3个株系(Line-2、Line-11、Line-16)进行耐低磷分析显示,低磷胁迫下转基因烟草中磷含量、生物量、Apase活性、POD活性及SOD活性均显著高于野生型,而正常磷及高磷条件下两者并无明显差异,因此,超表达PmMYB169基因显著提高了植株的耐低磷能力。

【目的】ZmAN14是玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族成员,该家族在水稻中广泛参与非生物胁迫应答。通过分析玉米旱21(H21)及转ZmAN14烟草在非生物胁迫下的表达情况,为玉米ZmAN14及其家族的功能和分子机制的全面解析提供新信息。【方法】通过对ZmAN14进行序列分析,发现其属于玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族。以玉米自交系H21为研究材料,在三叶期时对其进行非生物胁迫和ABA诱导处理,0、1、3、6、12和24 h时取整株样品,同时在玉米不同生长期取根、茎、叶、胚芽鞘、雌蕊、雄蕊、花丝、苞叶等不同组织样品,利用实时荧光定量PCR方法对ZmAN14的组织表达谱和非生物胁迫及ABA...

【目的】 将来源于大豆细菌性斑点病菌（Pseudomonas syringae pv.glycinea）Psg12菌株的hrpZPsg12基因导入烟草“云烟87”，对转化植株进行烟草普通花叶病毒（TMV）、烟草马铃薯Y病毒病（PVY）和烟草野火病（Pseudomonas syringae pv.tabaci）的抗病性鉴定，为培育多抗烟草新品系奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法，将hrpZPsg12基因转入烟草“云烟87”中，对T0和T1代转基因植株进行PCR检测、Southern杂交，并对T1代转基因植株的抗病性进行评价。【结果】hrpZPsg12基因成功转入“云烟87”中，PCR检测表明共获...