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[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
贾慧娜 罗海玲 刘昆 左兆云 张玉伟 王朕朕
为克隆滩羊肝脏α-生育酚转移蛋白(α-TTP)CDS区基因并构建其原核表达载体,通过Trizol法提取滩羊肝脏组织总RNA,将其反转录为cDNA后利用人工合成和PCR扩增相结合的方法得到α-TTP CDS区基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a,命名为pET28a-TTPA。结果表明:扩增了滩羊肝脏α-TTP CDS区基因,同已公布的绵羊α-TTP序列同源性达99.76%,并且将其成功克隆至原核表达载体pET28a。结果为后续α-TTP基因原核表达及其抗体的制备奠定了基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
丁勇 常玮 刘小烛
【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus)油体钙蛋白(caleosin)基因BnClo1,并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上,根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物,以甘蓝型油菜种子总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约750bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中,构建融合表达载体pTYB12-BnClo1,转化到Escherichia coli ER2566(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长768bp,包含完整的开放阅读...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
刘声传 鄢东海 周雪 曹雨 莫雪 胡伊然 周玉锋
为了发掘利用茶树（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）富硒关键酶硒代半胱氨酸甲基转移酶（ｓｅｌｅｎｏＣｙｓｔｅｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ｓｍｔ）基因Ｃｓ ｓｍｔ，基于宁州２号转录组测序结果，通过ｒａＣｅ克隆该基因的Ｃ Ｄｎａ全长，并通过原核表达和蛋白质印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）验证该基因，然后构建超表达载体，转化至根癌农杆菌。结果表明：该基因Ｃ Ｄｎａ全长为１２７７ ｂｐ，开放阅读框（ｏｐｅｎ ｒｅａＤｉｎｇ ｆｒａｍｅ，ｏｒｆ）为１ ０５０ ｂｐ，与ｎＣｂｉ公布的茶树该基因ｏｒｆ序列有８个点突变，且缺少ｇｔＣｇｔＣ序列。Ｃｓ ｓｍｔ基因编码３４９个氨基酸，其氨．．．
关键词：
茶树 硒 Cs SMT 原核表达 超表达
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张蕾 李新生 崔保安 陈红英 孙凯 宋亚鹏
根据GenBank基因库中HLA-A胞外区成熟肽基因序列设计2对引物,用RT-PCR法从健康人血液中扩增HLA-A胞外区基因,扩增产物进行T-A克隆、测序.结果表明,获得的HLA-A胞外区基因大小为819bp,与模板序列的同源性为96%.利用基因重组技术,将HLA-A胞外区基因亚克隆入pET-21a(+)载体中.经PCR、酶切和测序鉴定,证实所获重组表达质粒pET–21/HLA-A中含有目的片段,且连接、构建正确,表明成功构建了重组表达质粒pET–21/HLA-A.
[期刊] 海洋渔业
[作者]
苏艳芳 付元帅 施志仪 张红梅 高丽娜
采用RACE-PCR技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)组织中克隆了血清应答因子(SRF)基因全长序列,该序列全长2 477 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸。通过氨基酸同源序列比对,牙鲆SRF与其它物种的同源性较高,在氨基酸序列的N端具有NLS结构域和高度保守的MADS结构域。用PCR方法扩增SRF基因的编码区片段,克隆到p EGFP-N1载体中,构建真核表达载体p EGFP-N1-SRF,将重组质粒转染牙鲆胚胎细胞,在荧光显微镜下观察转染细胞有绿色荧光蛋白表达。荧光定量PCR和Western blot实验进一步证实,SRF在转染细胞中高表达。说明...
关键词：
SRF 牙鲆 克隆 真核表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王宝维 张倩 葛文华 张名爱 岳斌 黄国清
【目的】鹅源草酸青霉F67(Penicillium oxalicum Currie & Thom)纤维素酶二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBHⅠ)基因克隆并构建真核表达载体,为该菌株分子特性的进一步研究及构建高效纤维素分解菌奠定基础。【方法】首先通过兼并PCR法扩增CBHⅠ基因片段,然后利用改良热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术克隆CBHⅠ基因5′端和3′端侧翼序列,最后采用RT-PCR法扩增鹅源草酸青霉F67CBHⅠ基因序列全长,并对该基因进行生物信息学分析,构建pPIC9K真核表达载体。【结果】分别扩增到鹅源草酸青霉F67纤维素酶CBHⅠ基因片段A(EU57473...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
曾国航 徐宏伟 李莲瑞
【目的】构建新疆多浪羊ＩＬ－１β基因编码区的原核表达载体，在大肠杆菌中进行诱导表达，为进一步研究ＩＬ－１β蛋白的结构功能奠定基础。【方法】从含质粒ｐＭＤ－１８Ｔ－ＩＬ－１β的大肠杆菌ＤＨ５α中获取ＩＬ－１β基因，与ｐＥＴ－２８ｂ质粒ＤＮＡ连接，构建原核表达载体ｐＥＴ－２８ｂ－ＩＬ－１β。先将其转化到克隆载体Ｅ．ｃｏＬＩ ＤＨ５α感受态细胞中大量拷贝，经菌液ｐｃＲ和ＥｃｏＲⅠ、ＸＨｏⅠ双酶切鉴定后，提取ｐＥＴ－２８ｂ－ＩＬ－１β质粒转化到表达载体Ｅ．ｃｏＬＩ ｂＬ２１（ＤＥ３）中，再次进行菌液ｐｃＲ和ＥｃｏＲⅠ、ＸＨｏⅠ双酶切鉴定。将阳性单克隆接种于Ｌｂ液体培养基，以终浓度为１ＭＭｏＬ／Ｌ Ｉｐ．．．
关键词：
多浪羊 IL-1β基因 原核表达
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
马应 张天闻 梅山 周小南 赵志艳 冯登侦 康晓龙
克隆滩羊脂肪肥胖相关基因(FTO)的编码区序列(CDS),采用生物学软件和在线预测工具对FTO基因进行分子特征分析，通过实时荧光定量PCR检测FTO基因mRNA在滩羊各组织以及不同绵羊群体背最长肌中的表达水平，为研究FTO基因在滩羊及其杂交后代的生产性能以及新品种选育提供参考数据。结果表明：滩羊FTO基因CDS全长1 560 bp,编码519个氨基酸，存在1个错义突变，导致缬氨酸突变为蛋氨酸；滩羊FTO蛋白为亲水性蛋白，不存在跨膜结构，在第33～34氨基酸残基处具有信号肽；构建的系统发育进化树显示，滩羊与山羊的亲缘关系最为接近。FTO基因mRNA在滩羊背最长肌中的表达水平最低，在不同绵羊群体背最长肌中的表达水平存在显著差异，表达水平表现为：杜泊羊>杜滩寒杂交一代>滩羊>小尾寒羊；肉用绵羊(杜泊羊)FTO基因mRNA的表达水平相对高于其他非肉用品种。
关键词：
FTO基因 滩羊 脂肪沉积 组织表达
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李英奇 梁雅旭 高霄霄 万珍 张国敏 王锋
[目的]本试验旨在探讨高能饲粮对湖羊肝脏组织细胞增殖、能量代谢和脂代谢相关基因表达的影响。[方法]选取36只体况良好、体质量相近的3月龄湖羊公羔，随机分为正常日粮组(CON)和高能日粮组(HE),每组3个重复，每个重复6只。CON组和HE组个体饲喂日粮的能量水平分别为10和11 MJ·kg~(-1)。预饲14 d后正式饲喂60 d,试验结束后屠宰并采集肝脏组织，用于H&E染色、免疫组化检测和荧光定量PCR(qPCR)、Western blot检测。[结果]H&E染色显示HE组湖羊肝脏组织中出现轻度空泡样变性；免疫组化发现PCNA蛋白主要表达于肝细胞核中，mTOR和LXRα蛋白主要定位在肝细胞质中。高能饲粮饲喂显著提高肝脏组织PCNA和SREBP-1c的mRNA与蛋白表达水平(P<0.05),显著降低肝脏组织LKB1和AMPK的mRNA与蛋白的表达水平(P<0.05),显著降低肝脏组织PGC-1α和SIRT1的蛋白表达水平(P0.05)。[结论]提高湖羊的日粮能量水平能增强湖羊肝脏组织的细胞增殖及脂肪合成能力。
关键词：
湖羊 肝脏 能量代谢 脂代谢
[期刊] 林业科学
[作者]
冀宪领 盖英萍 马建平 牟志美
景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)是卡尔文循环过程中的关键酶。利用RACE技术得到景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因全长cDNA,命名为MSBPase(GenBank登录号:DQ995346)。MSBPase全长为1527bp,该序列含有1个1179bp的完整开放读码框,编码393个氨基酸,蛋白质理论分子质量约为42.6ku,等电点为5.85,其氨基酸序列与其他植物中已分离的SBPase有很高的同源性。对MSBPase编码的蛋白质(命名为MSBPase)进行结构预测分析表明,该蛋白富含无规卷曲(coil),高达64.29%,其次是α-螺旋(helix),为22.19%,而β-折叠(st...
[期刊] 华北农学报
[作者]
苏丽艳 李正国 樊晶 高雪 杨迎伍 邓伟 郝彦伟
从脐橙果皮褐变相关基因的cDNA抑制差减文库中,获得了一个CAB基因家族的同源EST序列,通过快速扩增cDNA末端(RACE)方法成功克隆得到984bp的CsCAB全长基因(GenBank登录号EF010854)。序列分析结果表明,CsCAB包含一个621bp的开放阅读框(ORF),编码207个氨基酸;CsCAB蛋白与钙结合蛋白具有很高的同源性,且具有钙结合蛋白的保守结构域EF-hand。并构建了脐橙CsCAB基因的正、反义植物表达载体pCAMBIA1301-CABs和pCAMBIA1301-CABas,为该基因的功能研究奠定了基础。
关键词：
脐橙 CsCAB 克隆 表达载体 构建
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
姚新灵 万巧风 陈彬 李珺 丁海麦 狄建军 郭蔼光
为了研究不同启动子驱动的反义SAGP抑制内源ADP-Glc PPase小亚基编码基因表达的效果,创造适于外源基因表达的突变体,利用RT-PCR方法,由马铃薯块茎cDNA克隆获得ADP-Glc PPase小亚基编码基因(SAGP)的1 821 bp cDNA。核酸数据库检索和序列比对分析表明,已克隆的SAGP基因cDNA推测编码607个氨基酸组成的多肽,其中第312和411的天冬酰氨均突变为丝氨酸。以pCambia为基础,分别构建了CaMV35S和GBSSI块茎启动子驱动的小亚基cDNA反义结构植物表达载体。
[期刊] 华北农学报
[作者]
任磊 王雁 周琳 彭镇华
以牡丹品种赵粉为试材,采用RT-PCR和RACE方法从雄蕊中获得了一个牡丹苹果酸脱氢酶基因cDNA全长,命名为PsMDH,GenBank登录号为HQ449567。其cDNA全长1 283 bp,包含80 bp的5'非编码区、203 bp的3'非编码区和一个长度为999 bp编码332个氨基酸的开放阅读框。序列比对和系统进化分析表明,PsMDH与毛果杨的亲缘关系最近,相似性达93.37%以上。相对荧光定量PCR分析表明,PsMDH在心皮中的表达量最高,在雄蕊中表达量最低。成功构建植物表达载体,为牡丹品种改良提供基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
田华 徐春霞 段美洋 黎国喜 唐湘如
利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)得到在水稻中特异性表达的脯氨酸氧化酶(PRO)基因。DNA序列分析表明,所获得水稻的PROcDNA的最大开放阅读框序列全长为1 428 bp,可编码476个氨基酸。该序列与NCBI网站上已发表的PRO基因100%相似。为了能进一步验证所克隆的序列是我们所需的目的基因,成功构建了PRO基因超表达载体和PRO基因干涉载体,便于导入水稻中进行基因的功能鉴定。
关键词：
香稻 脯氨酸氧化酶 基因 克隆 表达载体
[期刊] 华北农学报
[作者]
苑博华 蒋继志 刘红梅
分别以质粒pBV221和pPIC9K为表达载体,成功构建了PRRS病毒E基因克隆载体,转化后经抗性筛选、PCR扩增、双酶切鉴定,确认得到了含有目的基因的阳性克隆。对含有E蛋白原核表达载体的阳性克隆进行诱导表达,经过酶联免疫鉴定,结果显示外源蛋白在宿主菌中有表达,成功实现了在大肠杆菌细胞中的克隆。本研究成功构建了PRRSV BJ-4毒株E基因的原核表达载体和真核表达载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。
关键词：
PRRSV 基因克隆 原核表达 真核表达
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