【目的】建立高效的滇杨Populus yunnanensis离体叶片再生及遗传转化体系，有助于滇杨基因工程育种研究。【方法】以滇杨叶片为外植体，研究不同植物生长调节剂组合对叶片愈伤组织和不定芽诱导及生根的影响，从而获得滇杨再生组培苗；进一步以农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法探讨菌液吸光度、侵染时间和共培养时间等对滇杨遗传转化效率的影响。【结果】滇杨愈伤组织诱导的最适培养基为1/2 MS+0.005 mg·L~(-1)噻苯隆(TDZ)+0.010 mg·L~(-1)萘乙酸(NAA)，诱导率达91.7%；不定芽诱导的最佳培养基为1/2 MS+0.002 mg·L~(-1) TDZ+0.010 mg·L~(-1) NAA，诱导率为75.0%；生根最适培养基为1/2 MS+0.010 mg·L~(-1) NAA+0.100 mg·L~(-1)吲哚乙酸(IBA)，生根率高达96.7%，平均生根数为2.57条。利用pBI121-GUS载体转化滇杨，最适转化菌液吸光度D(600)为0.2，侵染时间为5 min，共培养时间为2d；在分化过程中，抑制农杆菌生长的头孢霉素(Cef)最佳质量浓度为200 mg·L~(-1)，抗性筛选中最佳培养基的卡那霉素(Kan)质量浓度为20 mg·L~(-1)。对再生植株进行β-D-葡萄糖苷酸酶(GUS)组织化学染色和PCR鉴定，获得20株阳性植株，转化阳性率为45.45%。【结论】本研究成功建立了滇杨离体叶片再生和遗传转化体系。图5表5参27

为了优化84 K杨的再生和遗传转化体系,以84 K杨树叶片为外植体,采用正交试验研究了不同培养基和激素配比对芽和芽苗生根的影响,并从预培养时间、浸染菌液浓度、浸染时间、共培养时间及添加AS(乙酰丁香酮)5个方面,以卡那霉素抗性苗频率为衡量指标,研究了各因素对84 K杨遗传转化率的影响。结果表明,84 K杨叶片最适的芽诱导培养基及激素配比为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L,芽苗最适诱导生根培养基及激素配比为1/2 MS+NAA 0.05 mg/L+IBA 0.05 mg/L;优化筛选的最适转化体系为:农杆菌活化菌液用MS液体培养基稀释10倍,浸染5 min,共培养4 ...

为建立地被菊‘中国红’的再生和遗传转化体系，以其无菌苗叶片为外植体，通过添加不同浓度的生长调节剂，研究其对诱导愈伤组织、不定芽的影响，并利用根瘤农杆菌介导法对地被菊‘中国红’叶片进行遗传转化，研究影响菊花转化的若干因素，建立一套高效的遗传转化体系。结果表明：地被菊‘中国红’在ＭＳ＋２．０Ｍｇ·Ｌ－１６－ＢＡ＋０．２Ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ的培养基上获得了最高的不定芽分化率（８９．６％）；地被菊‘中国红’的最适生根培养基为１／２ＭＳ＋０．３Ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ，生根率达１００％；其叶片外植体的遗传转化条件：ＯＤ６００＝０．６、农杆菌侵染时间为７ＭｉＮ、共培养４８ｈ、延迟培养２Ｄ、卡那霉素筛选浓度为１５Ｍ．．．

以匍匐型地被菊雨花勋章叶片为外植体,建立了其高频再生体系及根癌农杆菌介导的稳定遗传转化体系。结果表明,不同激素配比对叶片离体再生影响很大,以MS+1.0 mg.L-16-BA+1.0 mg.L-1NAA的诱导率最高,达91.1%;分化前期一定时间的暗培养可防止愈伤组织褐变,提高再生率。预培养3 d,侵染10 m in,共培养3 d,延迟培养3 d为最优转化体系;乙酰丁香酮导致外植体褐化加速,不利于转化。叶片对潮霉素十分敏感,叶盘再生筛选以6~8 mg.L-1为宜,生根筛选以7 mg.L-1为宜。羧苄青霉素抑菌质量浓度以250~350 mg.L-1为宜。获得的抗性芽部分株系经PCR检测初步证实外...

通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,建立香樟胚性愈伤组织遗传转化体系。结果表明:以胚性愈伤组织为受体,能取得比较理想的转化效果;50mg.L-1的潮霉素对胚性愈伤组织有很好的筛选效果;根癌农杆菌0D600为0.6时,能获得较高的转化率;侵染时间提高为40min时,对提高转化效率有显著的效果;共培养3d能够得到较好的转化效率。对转基因香樟愈伤组织进行PCR检测,结果表明GUS基因已整合到香樟胚性愈伤组织的基因组中。

对铁线莲(Clematis florida‘Blekitny Aniol’)的带芽茎段进行诱导产生无菌苗,并对其叶片和茎段进行愈伤组织诱导成苗的分化研究,成功建立了铁线莲组织培养再生体系。结果表明,带芽茎段诱导腋芽最佳培养基为MS+1mg·L(-1)6-BA+0.05 mg·L(-1)NAA,腋芽萌发率为100.0%;茎段诱导愈伤最适宜培养基为MS+2 mg·L(-1)6-BA+0.01mg·L(-1)NAA,诱导率为78.3%;叶片诱导愈伤组织最适宜的培养基为MS+1 mg·L(-1)6-BA+0.1

以迷你岩桐(Sinningia hybrida ‘Isa’s Murmur’)带柄叶片为外植体,探讨了外植体的灭菌方法、不同基本培养基以及外源激素(6-BA、NAA、IBA)对愈伤组织和不定芽的诱导及增殖、生根等的影响,成功建立了迷你岩桐组织培养植株再生体系。结果表明:迷你岩桐带柄叶片在75%乙醇灭菌10 s,0.1%升汞灭菌300 s时,污染率较低(15.56%)而启动率较高(85.56%)。在MS培养基中添加2.0 mg·L~(–1) 6-BA和0.1 mg·L~(–1) NAA时,愈伤组织诱导率最高(91.11%)。在1/2 MS培养基中添加2.0 mg·L~(–1) 6-BA和0.05 mg·L~(–1) NAA时,不定芽诱导率为88.89%。在MS培养基中同时添加2.0 mg·L~(–1)6-BA和0.1 mg·L~(–1) NAA时,不定芽增殖效果最好,增殖倍数为2.38。1/2 MS+0.10 mg·L~(–1) IBA培养基有利于生根,生根率为87.78%。腐殖土∶泥炭土∶河沙以体积比为1∶2∶2的混合基质为移栽基质时,瓶苗移栽成活率可达96.67%。本研究结果可为迷你岩桐的遗传转化体系的构建及规模化生产提供一定的理论基础和技术支撑。

以适宜西北地区种植的优质牧草冰草属(AgropyronGaertn)中的三个不同种———蒙古冰草新品系(A.mongolicumKeng)、航道冰草(A.cristatumcv.Fairway)、诺丹冰草(A.desertorumcv.Nordan)和一个种间杂种冰草———蒙农杂种冰草(A.cristatum×A.desertorumcv.Mengnong)为材料,分别以幼穗为外植体建立了冰草组织培养再生体系。诱导愈伤组织的培养基为改良MS+2,4 D2.0mg/L,分化培养基为MS(无附加成分),在1/2MS培养基上生根后得到完整小植株。结果表明在本试验条件下,不同长度的幼穗在培养时,其愈伤...

【目的】以扭果花旗杆(Dontostemon elegans)根和下胚轴为外植体,建立扭果花旗杆组织培养体系,为后续遗传转化体系的建立提供技术基础。【方法】以MS培养基为基础培养基,利用萘乙酸(NAA)探究根和下胚轴直接诱导不定芽情况,利用2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、NAA、苯基噻二唑基脲(TDZ)、吲哚丁酸(IBA)进行愈伤组织诱导及分化和不定芽生根试验,统计愈伤组织诱导及分化和不定芽生根情况,确定扭果花旗杆组培体系最佳培养基类型。【结果】(1)由根和下胚轴直接诱导不定芽的最适培养基分别为MS+0.3 mg/L NAA和MS+0.6 mg/L NAA,直接诱导不定芽的最佳外植体为根。(2)扭果花旗杆根和下胚轴都能诱导愈伤组织,其中根系诱导愈伤组织速度最快且状态最佳,其次为下胚轴。根系愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+1.0 mg/L 2,4-D+0.2mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA,诱导率可达100.00%;下胚轴愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+0.3 mg/L 2,4-D+1.5 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA,诱导率可达100.00%。(3)根系和下胚轴的最佳愈伤组织分化培养基均为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA,分化率分别为100.00%和86.66%。(4)最佳生根培养基为MS+0.5 mg/L IBA,生根率可达50%以上。(5)将组培苗移至土壤后,在光照培养室培养15 d,其存活率可达83.33%。【结论】建立的扭果花旗杆组培体系可获得与实生苗形态一致的组培苗,为扭果花旗杆遗传转化体系的建立奠定了技术基础。

采用根癌农杆菌介导的国槐叶盘转化法,在建立修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)转化体系过程中,对影响农杆菌转化频率的各种因素进行研究。结果表明:国槐叶片需在黑暗条件下在MS培养基上预培养5天,农杆菌菌株选用GV3101,农杆菌共培养3天较合适;农杆菌菌液浓度OD600约为0.7,感染时间10min;侵染前的菌液和共培养基中添加200μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)对国槐遗传转化有明显的促进作用;抑制农杆菌生长的抗生素浓度以头孢霉素(Cef)500mg·L-1最好。PCR和Southern blotting检测证实sck基因已整合到国槐基因组中。

【目的】建立PEG介导的高效银耳(Tremella fuciformis)芽孢遗传转化体系。【方法】采用PEG介导的原生质体法把表达质粒pAN7-1(含有构巢曲霉gpd-An启动子和潮霉素抗性基因hph)和pLg-hph(含香菇gpd-Le启动子和hph基因)转化进银耳芽孢的细胞中;采用夹层法在含50μg·ml-1潮霉素的筛选培养基中初筛银耳芽孢假定转化子,之后转接于潮霉素含量为100μg·ml-1的PDA平板上进行第2次筛选。【结果】PEG4000浓度为25%时介导的银耳芽孢原生质体初转化率最高;pLg-hph假定转化子经过PCR鉴定及Southern杂交验证,结果表明hph基因能有效整合进...

为探究马铃薯的最佳遗传转化体系，以紫色马铃薯‘华颂66号’无菌组培苗茎段为外植体，用农杆菌介导法将含有植物沉默载体质粒pBWA(V)KS-miR8019转化马铃薯外植体，测定不同预培养时间、不同激素组合及抗生素对马铃薯愈伤再生转化体系的影响。结果表明：1）茎段预培养时间为2 d时，愈伤组织诱导率最高；2）最适的外植体愈伤组织诱导的培养基配方为：MS干粉式培养基+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D，愈伤组织的诱导率为96.7%。最适愈伤组织分化的培养基为：MS干粉式培养基+4.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L GA_3;3）植株再生及生根的抗生素最适筛选浓度为75 mg/L的卡那霉素；4）农杆菌抑制剂的最适浓度为300 mg/L的特美汀，且在愈伤组织诱导、分化及生根阶段都需要加入。综上，通过对农杆菌介导的愈伤再生转化过程中各个影响因素进行试验，初步建立了马铃薯‘华颂66号’的遗传转化体系。

[目的]本试验的目的是通过瞬时转化解决菊花转基因中存在的两大难题:转化效率低和表达水平低。[方法]通过农杆菌注射渗透法将含有GUS基因(编码β-葡糖苷酸酶)的表达载体pORE R1-2×35S∷GUS转入菊花‘优香’叶片中,进行瞬时表达,并组织培养转化后的叶片,利用GUS化学染色法和RT-PCR进行转化植株鉴定。[结果]菊花‘优香’瞬时表达的转化效率高达76.7%,外源基因(GUS)的表达水平也较理想,尤以第4和第5片完全展开叶(从形态学上端向形态学下端数)表现最佳。经过34个月的组织培养和抗性筛选,瞬时

以水稻两用不育系培矮64S成熟胚为外植体,以不同组合培养基为诱导和继代培养基,建立了适合水稻培矮64S转化的高效再生体系,并通过农杆菌EHA105介导,将大肠杆菌C1基因转入培矮64S,获得再生植株。结果表明,J0N1D3为合适的愈伤组织诱导培养基,诱导率达56.44%;通过潮霉素筛选后,获得的抗性愈伤组织分化率为73.08%,经分化,获得133株再生植株;随机挑选67株再生植株经PCR检测,其中46株检测到目的条带,阳性检出率占68.66%;对PCR阳性植株进行荧光定量实时PCR分析,结果表明C1基因能在转基因植株中表达。通过对T1代PCR分析,得到目的条带,表明C1基因能在转基因后代稳定遗...

【背景】马铃薯是最重要的块茎类粮食作物。栽培马铃薯以四倍体为主,但四倍体遗传和薯块繁殖增加了马铃薯改良的难度。因此越来越多的科学家呼吁在二倍体水平进行马铃薯的再驯化,将马铃薯驯化成种子繁殖作物。自然界中存在4个二倍体马铃薯原始栽培种,这些二倍体栽培种中蕴含着丰富的遗传变异,但是它们的遗传转化体系尚未成熟。【目的】建立高效的二倍体栽培马铃薯遗传转化体系,为二倍体马铃薯优良等位基因和分子育种提供工具。【方法】以二倍体栽培种马铃薯(Solanum phureja)CIP 703541为试验材料,利用绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)作为报告基因,对遗传转化体系进行摸索,主要包括:预处理培养时间、诱导再生的激素比例、抗生素浓度以及转化效率。另外,利用同样的激素组合对17份不同基因型的二倍体马铃薯原始栽培种进行了测试,比较各个材料在不同激素浓度条件下的再生效率,筛选出再生效率较高的激素组合进行大量遗传转化;对再生苗进行生根筛选、荧光观察和PCR鉴定,统计阳性植株的概率。用流式细胞仪检测阳性植株的倍性,以分析再生植株发生染色体加倍的频率。【结果】预处理培养时间为2 d的外植体浸染效率最高。二倍体材料CIP 703541最适合再生出芽的激素配方为2.0 mg·L~(-1)玉米素(zeatin,ZT)﹕0.01 mg·L~(-1)奈乙酸(naphthaleneacetic acid,NAA)。再生阶段抗生素卡那霉素(kanamycin,Kan)的最适筛选浓度为100 mg·L~(-1),生根阶段的最适筛选浓度为50 mg·L~(-1)。通过对不同基因型进行筛选,获得3份再生能力较强的二倍体马铃薯材料(CIP 703308、CIP 703312和CIP 703541)。它们响应的激素配方各不相同,在添加了100 mg·L~(-1)卡那霉素的再生培养基中,3份材料的再生效率分别为45%、40%和52%。通过大规模遗传转化证明,3份材料的转化率分别为2.8%、4.2%和5.3%。经流式细胞仪检测,所获得的马铃薯阳性植株中四倍体的比例较高,CIP 703308、CIP 703312和CIP 703541的阳性转化植株中二倍体的比例分别为5.26%、10.53%和38.46%。【结论】建立了高效的二倍体马铃薯遗传转化体系,获得了3份再生能力较强的二倍体材料。另外,发现二倍体马铃薯在经过遗传转化之后再生植株中染色体加倍的比例较高。